类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性炎性反应性疾病，以滑膜炎和骨质破坏为主要病理特征，可引起软骨和骨骼的损伤，甚至导致残疾[1]。破骨细胞是由单核细胞系分化而来的多核巨细胞，主要行使骨吸收功能，其分化增强可导致骨破坏加重[2]。
姜黄素(curcumin，Cur)是从中药姜黄中提取的一种低分子量的酚类物质，姜黄为姜科植物姜黄或郁金的干燥根茎，具有破血行气、通经止痛之功效，已有研究发现姜黄素能改善RA患者疾病活动度[3]。本课题前期研究发现姜黄素能调节核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)/骨保护素(osteoprotegerin，OPG)比值，提高佐剂性关节炎大鼠骨密度(bone miner density, BMD)水平[4]，并且具有抑制RA患者破骨细胞生成数量和活性的作用[5]，然而其作用机制尚不明确，本研究初步探讨其机制。
对象与方法 对象选择2015-2016年在解放军南京总医院门诊或住院治疗的RA患者12例，男性2例，女性10例，平均年龄(56.25±15.10)岁，均符合美国风湿病学会(American College of Rheumatology，ACR)和欧洲抗风湿病联盟(European League Against Rheumatism，EULAR)共同制定的2010年RA分类标准[6]，排除并发严重心、肝、肾疾病、糖尿病者，半年内曾服用降钙素、双膦酸盐等影响骨代谢药物者，以及近2年内曾使用糖皮质激素者。
方法主要试剂：α-MEM培养基(美国Gibco公司)，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(杭州四季青公司)，RANKL、巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)(美国Pepro Tech公司)，人淋巴细胞分离液(美国Sigma公司)，TRAP染色试剂盒(南京建成公司)，姜黄素标准品(南通飞宇公司)，NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-кB，IκBα)抗体、磷酸化IκBα(p-IкBα)抗体、NF-κB p65抗体(美国Cell Signaling公司)。
RA破骨细胞的诱导与培养：取RA患者晨血3 mL，检测白细胞计数在正常范围者，每例再抽取静脉血15 mL用于细胞实验，采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)。于50 mL离心管中加入上述血标本，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)1:1稀释混匀；另取50 mL离心管，将15 mL淋巴细胞分离液加入离心管底部，沿管壁将30mL上述稀释血缓慢加于淋巴细胞分离液上，20 ℃下400×g离心20 min；离心后，试管内液体明显分层，吸取白膜层(单个核细胞层)收集于另一离心管内；加入适量PBS，混匀，250×g离心10 min，弃上清，再按上述方法，用PBS洗涤2次，弃上清，获得RA患者PBMCs。加入α-MEM完全培养液重悬，获得PBMCs细胞悬液，以2×106个/cm2的密度接种于培养皿中[7]，在37 ℃、5% CO2培养箱内孵育2~3 h，吸除皿内培养液以去除悬浮细胞，将贴壁细胞用胰酶消化，将细胞调节成2×105个/cm2接种于24孔板中，用含100 μg/L RANKL、50 μg/L M-CSF及20% FBS的α-MEM完全培养液培养，置于37 ℃、5% CO2培养箱中，2~3 d换液1次。
分组：参照本课题组前期进行的CCK-8检测姜黄素对PBMCs毒性作用的实验结果[8]，选用对PBMCs细胞活力无明显影响的姜黄素浓度(2.5、5、10 μmol/L)进行干预，设置分组：对照组、Cur 2.5 μmol/L组、Cur 5 μmol/L组、Cur 10 μmol/L组，每组设3个复孔。
细胞形态学观察：用倒置显微镜观察培养细胞的形态、细胞融合以及多核细胞形成的情况，并拍照。
TARP染色并计数：将RA患者PBMCs在含不同浓度姜黄素的20% FBS α-MEM完全培养液(100 μg/L RANKL、50 μg/L M-CSF)中培养，2~3 d换液。14 d后行TRAP染色，参照TRAP染色液说明书(南京建成公司)操作，光镜下观察染色结果，并随机选取10个视野，计数TRAP阳性细胞(细胞核≥3个，胞质呈酒红色)，结果用“个/10个视野”表示，每孔重复计数3次。
Western blot法检测各组破骨细胞IκBα、p-IκBα的表达：细胞培养至第14天，提取细胞总蛋白，进行蛋白定量，100 ℃变性3~5 min，上样后连接至电泳仪，100 V，15 min，120 V，1 h进行蛋白电泳、转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，IκBα、p-IκBα一抗4 ℃孵育过夜，以β-actin为内参，二抗室温振荡孵育2 h，滴加ECL试剂于X线下曝光显影。实验重复3次，计算各条带的灰度值，结果以目的蛋白与内参蛋白灰度值之比来表示。
Western blot法检测细胞质和细胞核中NF-κB p65的表达：细胞培养至第14天，用细胞核蛋白与细胞质蛋白抽提试剂盒提取细胞核蛋白和细胞质蛋白，进行蛋白定量，100 ℃变性3~5 min，上样后连接至电泳仪，100 V，15 min，120 V，1 h进行蛋白电泳、转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，将细胞核蛋白和细胞质蛋白膜加入NF-κB p65一抗4 ℃孵育过夜(胞质蛋白以β-actin为内参，核蛋白以Lamin B1为内参)，二抗室温振荡孵育2 h，滴加ECL试剂于X线下曝光显影。实验重复3次，计算各条带的灰度值，结果以目的蛋白与内参蛋白灰度值之比来表示。
统计学方法采用SPSS 19.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，多组间均数比较，采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。
结果 细胞形态学观察观察第1天接种于24孔板中的细胞，分布均匀，贴于细胞培养板底部，数量较多，呈圆形或类圆形，折光性强。培养至第7天，观察见部分相邻的细胞融合，细胞体积增大，轮廓清晰，呈椭圆形或不规则形，有些有细长的伪足，细胞核体积也增大，呈圆形或椭圆形。培养至第14天，胞体明显增大，可见多个多核细胞，折光性强，形态有油煎蛋形、漏斗形或不规则形，有裙状或丝状伪足，胞内有3~5以上的细胞核，胞质中有较多空泡，符合破骨细胞的形态特征(图 1)。
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| 图 1 倒置显微镜下细胞形态(×200) Figure 1 Morphological observation of cells under microscope(×200) A：第1天；B：第7天；C：第14天 |
光镜下可见，TRAP染色后胞质呈紫红色，细胞核呈蓝紫色，Control组为正常破骨细胞，具有形态均一、细胞分布均匀、致密，轮廓清晰的特征，细胞核3~5个不等，符合破骨细胞TRAP染色特征(图 2)。与对照组比较，Cur 2.5、5和Cur 10 μmol/L组TRAP阳性细胞数均明显减少(P＜0.05)(图 3)。
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| 图 2 TRAP染色结果(×200) Figure 2 TRAP staining(×200) A.对照组；B.Cur 2.5 μmol/L；C.Cur 5 μmol/L；D.Cur 10 μmol/L；TRAP：抗酒石酸酸性磷酸酶 |
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| 图 3 姜黄素对RA患者破骨细胞生成数量的影响 Figure 3 Effects of curcumin on the number of osteoclasts in RA patients RA：类风湿关节炎；TRAP：抗酒石酸酸性磷酸酶；Cur：姜黄素；与对照组比较，*P＜0.05 |
与对照组相比，Cur 2.5、5和Cur 10 μmol/L组IкBα的蛋白表达水平明显升高，p-IκBα的表达水平明显下降(P＜0.05)(图 4)。
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| 图 4 姜黄素对RA患者破骨细胞IκBα、p-IκBα表达的影响 Figure 4 Effects of curcumin on expression of IκBα and p-IκBα in osteoclasts of RA patients A:电泳图；B:各组IκBα相对灰度值；C:各组p-IκBα相对灰度值；RA：类风湿关节炎；IκBα：NF-κB抑制蛋白；p-IκBα:磷酸化IκBα；Cur：姜黄素；与对照组比较，*P＜0.05 |
与对照组相比，Cur 2.5、5和Cur 10 μmol/L组细胞质中NF-κB p65表达水平明显升高，而细胞核中NF-κB p65表达水平明显下降(P＜0.05)(图 5、6)。
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| 图 5 姜黄素对RA患者破骨细胞细胞质中NF-κB p65表达的影响 Figure 5 Effects of curcumin on expression of NF-κB p65 in cytoplasm of osteoclasts of RA patients A:电泳图；B:各组细胞质中NF-κB P65相对灰度值；NF-κB：核因子-κB；RA：类风湿关节炎；Cur：姜黄素；与对照组比较，*P＜0.05 |
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| 图 6 姜黄素对RA患者破骨细胞细胞核中NF-κB p65表达的影响 Figure 6 Effects of curcumin on expression of NF-κB p65 in cytoplasm of osteoclasts of RA patients A:电泳图；B:各组细胞核中NF-κB P65相对灰度值；NF-κB：核因子-κB；RA：类风湿关节炎；Cur：姜黄素；与对照组比较，*P＜0.05 |
姜黄素是从姜黄中获得的四萜类化合物，有报道显示，姜黄素具有抗炎、抗氧化和抗癌活性[9]。Kloesch等[10]研究表明姜黄素具有较强的抗炎特性，能诱导人成纤维样滑膜细胞凋亡，并建议将姜黄素作为慢性炎性反应性疾病如RA的天然疗法。此外，姜黄素能刺激破骨细胞凋亡[11]，抑制成骨细胞的增生和矿化[12]，从而影响骨代谢。本课题组前期通过动物实验研究发现，姜黄素可以改善佐剂性关节炎大鼠关节炎性反应，抑制滑膜血管新生及成纤维细胞异常增生[13]，调节RANKL/OPG比值，提高佐剂性关节炎大鼠BMD水平[4]。破骨细胞的异常增生与活化对RA骨侵蚀的发展具有重要作用，本研究前期研究发现姜黄素具有抑制RA患者破骨细胞生成数量和活性的作用[5]。本实验为进一步探索姜黄素在治疗RA骨破坏中的作用及其可能机制，以期为临床应用姜黄素治疗RA提供更多依据。
本实验采用姜黄素作为干预药物，以RA患者PBMCs为研究细胞，经RANKL诱导培养为破骨细胞，在培养过程中笔者观察到细胞由体积较小，呈圆形或类圆形的单核细胞逐渐生长分化，相邻细胞发生融合，形成体积较大、形状不规则、有皱褶缘的多核细胞，符合破骨细胞的形态学特征，与Boyle等[2]的描述相一致。并且观察到随着姜黄素浓度的增加，TRAP阳性细胞数减少，说明姜黄素具有抑制RA患者破骨细胞生成的作用。
破骨细胞的分化涉及数条通路，其中NF-κB信号通路是破骨细胞分化中的重要信号途径之一。NF-κB转录因子在细胞因子、病原体和辐射等刺激的影响下被快速的激活。在未受影响的细胞中，一些NF-κB转录因子与IκB蛋白结合，从而被隔离在细胞质中。而细胞受上述因素刺激后，IκB激酶(inhibitor of NF-κB kinase，IKK)复合物被激活，使IκB蛋白发生磷酸化，随后被泛素化酶识别，导致IκB被蛋白酶体降解，释放与IκB结合的NF-κB转录因子，使其移位到细胞核以驱动靶基因的表达[14]。本实验选用IκBα作为NF-κB信号活化的观测指标，对照组中IκBα表达较少而p-IκBα表达较多，提示破骨细胞形成过程中IκBα发生磷酸化从而导致NF-κB信号的活化，与Boyce等[15]描述的RANKL诱导的NF-κB活化过程相一致。与对照组相比，经姜黄素干预后，IκBα表达的增多而p-IκBα表达的减少，提示IκBα的磷酸化被抑制，说明姜黄素抑制了NF-κB的活化过程。
p65是NF-κB核转录因子的核心亚基，只有当p50：p65复合体转入到细胞核后NF-κB才能活化发挥功能。本实验分别提取细胞质蛋白和细胞核蛋白，检测NF-κB p65在细胞质和细胞核中的表达，观察NF-κB p65入核表达情况，结果显示姜黄素具有减少NF-κB p65入核表达的作用，提示姜黄素抑制了NF-κB信号的活化。
本研究表明，姜黄素可通过抑制IκBα的磷酸化和IκBα的降解，减少NF-κB p65的入核表达，从而抑制NF-κB活化，进而达到抑制RA患者破骨细胞生成的作用，为开发姜黄素相关药物应用于RA骨破坏的治疗提供实验依据。
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| (收稿日期：2017-08-23) |