2. 030001 太原，山西医科大学第一附属医院内分泌科
2. Department of Endocrinology, The First Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001
“罕见疾病”又称“孤儿病”，是一类发病率小于5/1万或患病率小于7.5/10万的疾病[1-3]。在中国，其被定义为发病率新生儿发病率＜1/1万或患病率小于1/50万的疾病[4]。目前，美国约有3千万罕见病病例，欧洲约有2.7千万~3.6千万罕见病病例[1, 5-6]，其中约一半患者为儿童[7]。我国目前罕见病患病人口的数量尚不清楚。
将7 000多种罕见疾病中主要累及骨骼系统的遗传性疾病称为“罕见骨骼疾病”。目前已发现400余种罕见骨骼发育遗传疾病[8]，这些罕见骨病多具有特殊的临床和影像学特征，以及分子和胚胎发育特点。
罕见骨骼疾病分类罕见骨骼疾病的临床与遗传异质性导致了其分类困难和繁杂。2012年，国际骨质疏松症基金会(International Osteoporosis Foundation，IOF)罕见骨骼疾病工作组(Skeletal Rare Diseases Working Group，SRD-WG)，以罕见骨病的代谢发病机制为分类标准，将其分为以下4类：(1) 成骨细胞、破骨细胞或骨细胞功能改变：骨吸收减少，骨吸收增加，骨形成减少，骨形成增加；(2) 骨基质蛋白改变：胶原代谢障碍，碱性磷酸酶代谢障碍等；(3) 骨骼微环境调节因子改变：核因子κB受体活化因子配体/护骨素/核因子κB受体活化因子(receptor activator for nuclear factor-κB ligand / osteoprotegrin / receptor activator for nuclear factor-κB，RANKL/OPG/RANK)系统障碍，糖基磷脂酰肌醇生物合成通路障碍，低密度脂蛋白受体相关蛋白5(lipoprotein receptor-related protein 5，LRP5)、骨形成蛋白受体改变等；(4) 钙调节激素活性改变：甲状旁腺素生成过多或缺乏，甲状旁腺受体信号通路障碍，维生素D代谢及作用障碍，磷稳态失衡等。
该分类方法包含了116种在线人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)表型与86种涉及骨矿盐稳态相关的基因。涵盖由于骨骼代谢改变引起的骨骼疾病及已出版或被列入OMIM和疾病分类表中的骨病。不包括由于胚胎发育障碍导致的骨骼发育不良、非代谢因素导致的骨骼疾病以及继发性骨骼疾病[9]。
罕见疾病致病基因的鉴定和研究策略一代测序
一代测序(Sanger测序)是检测罕见疾病致病基因突变的传统方法。该测序方法可测得长达1 000 bp的碱基序列，精确性为99.99%，已成为测序的金标准[10]。其可用于已知致病基因的罕见疾病的验证，也可与家系连锁分析结合用于新的致病基因突变检测。但是，该方法每次测序仅能检测一个目的基因片段，通量较低，成本高，耗时较长；同时，连锁分析需要拥有较多患者、多代遗传的大家系。显然，这对致病基因突变未知的罕见病研究存在局限性。
二代测序
二代测序技术(next-generation sequencing，NGS)，又称为大规模平行测序技术，其基本原理是“边合成边测序”，可实现上百万个测序反应同时进行，具有高通量、低成本和快速化检测的优点[11]。根据测序范围的不同，包括全基因组测序和全外显子组测序。
基于目标区域捕获的二代测序技术(target region sequencing)是将感兴趣的基因组区域集合成特异性探针，与基因组DNA在序列捕获芯片(或溶液)进行杂交，将目标基因组区域的DNA片段进行富集后再利用第二代测序技术进行测序的研究策略。全外显子组测序即为该种技术方法，其利用特殊的手段对全外显子组进行富集，并进行高通量测序。基本流程包括外显子区域序列的富集、高通量测序及测序数据的生物信息学分析[12]。此种测序方法针对性强，信息量大，效率高，与全基因组测序相比成本显著降低。此外，该方法适用于孟德尔遗传疾病的研究[13]，并且不受家系大小及患病人数的限制，在罕见疾病致病基因的研究中有较大优势。
主要罕见骨骼疾病研究的发现和应用近些年来，对罕见病的研究揭示了很多参与骨重建和骨代谢通路上的重要分子，加深了对骨重建调节的认识。随着技术的进步，将会有越来越多的罕见骨病及骨质疏松症的致病基因被鉴定和发现，这不仅利于阐明疾病的分子遗传机制，还推动了疾病靶向精准治疗的发展。下面对几种主要罕见骨病发病机制、重要骨代谢调控通路的研究成果，以及由此拓展的对骨质疏松症等复杂疾病新型治疗方法举例说明。
Paget's骨病与RANKL/OPG/RANK通路
Paget's骨病及其致病基因:Paget's骨病是一种代谢性骨病。其分布有地域差异，在英国最常见，55岁以上人群发病率为3.1%[14]，在中国罕见。该种骨病是一种局部骨转换率增加的疾病，主要由于局部破骨细胞功能失调，骨吸收增强，骨形成代偿性增加所致。其主要临床表现为骨痛、畸形和骨折，可有局部皮肤温度增高，耳聋，心血管异常，高钙血症及高钙尿症等并发症，少数可能恶变，但大部分患者表现为无症状。
Paget's骨病的发病机制复杂，涉及病毒感染理论和基因突变理论等，其中遗传因素在Paget's骨病的病因学上占重要地位。自20世纪90年代开始，对Paget's骨病的遗传学研究深刻地揭示了骨吸收主要调控通路RANKL/OPG/RANK的重要作用。目前已发现Paget's骨病的致病基因多位于该信号传导通路，如RANK[15-16]、SQSTM1[17]、OPG[18]、VCP[19]和hnRNPA2B1[20]等。
RANKL/OPG/RANK通路：RANKL是由TNFSF11基因编码的肿瘤坏死因子超家族成员。表达于破骨细胞系表面的RANK与表达于成骨细胞前体表面或分泌的配体RANKL结合，可激活下游通路，促进破骨细胞的增殖，分化及成熟。OPG由TNFSRF11B基因编码，是RANKL的诱饵受体。其与RANKL的结合可阻止RANKL与RANK结合，从而抑制破骨细胞形成，减少骨吸收[21]。研究发现，RANK的激活突变可造成严重Paget's骨病表现[15]，而OPG失活突变可导致特发性高碱性磷酸酶血症[22]。因此，通过干扰RANKL/OPG/RANK等，有可能改变骨重建水平，进而治疗骨重建异常的疾病，如骨质疏松症或骨溶解疾病。
地诺单抗：(狄诺塞麦，denosumab)是一种人免疫球蛋白G2(immunoglobulin G2，IgG2) 单克隆抗体同源体，对人RANKL具有高亲和性和特异性。其可通过与RANKL结合，抑制RANKL/RANK的相互作用，减少破骨细胞介导的骨吸收，增加骨密度[23]。该药物的药代动力学与其他人IgG2单克隆抗体类似，具有快速吸收、作用持久的优点，峰浓度(peak concentration，Cmax)出现在用药后1~4周、半衰期34 d，提示该抗体在骨吸收性疾病中应用的广泛前景。
FREEDOM(fracture eduction evaluation of denosumab in osteoporosis every six months)是一项随机安慰剂对照Ⅲ期临床研究。对7 868例绝经后骨质疏松女性随机皮下注射60 mg地诺单抗或安慰剂，每6个月1次，连续3年。结果显示，注射地诺单抗组椎体骨折发生率(2.3%)较安慰剂组(7.2%)降低68%(P＜0.001)，髋部骨折发生率(0.7%)较安慰剂组(1.2%)降低40%(P=0.036)；非椎体骨折发生率(6.5%)较安慰剂组(8.0%)降低20%，(P=0.011)。同时，地诺单抗可增加骨密度，降低骨转换水平。其不良事件与严重不良事件发生率与安慰剂大体相似，可能增加蜂窝织炎、湿疹、胃肠胀气的发生风险[24]。
目前，地诺单抗已经被用于治疗骨质疏松症、多发性骨髓瘤、肿瘤骨转移等骨吸收增加的骨病。
肥厚性骨发育不良与组织蛋白酶K
肥厚性骨发育不良(pycnodysostosis)：肥厚性骨发育不良最早报道于1923年，由于当时对其认识不足，并未有明确定义。1962年，Maroteaux等[25]通过对两例患者的分析，对疾病的特征做了充分描述。此类疾病表现为骨硬化，身高变矮，肢体远端的骨溶解以及骨脆性的增加，幼儿患者还可出现牙齿萌出延迟及囟门晚闭。X线检查可见弥漫性的骨硬化[26]。肥厚性骨发育不良是一种罕见的常染色体隐性遗传的骨软骨发育不良疾病，在人群中发病率为1~1.7/1百万，目前文献报道约200例[27]。
该种疾病的致病基因为CTSK[26]，位于常染色体1q21，包含7个外显子，编码组织蛋白酶K(cathepsin K)，它是半胱氨酸蛋白酶家族的成员，人类基因组该家族有11种半胱氨酸组织蛋白酶。组织蛋白酶K是一种在破骨细胞中高度表达的溶酶体蛋白酶，其主要作用是在酸性环境中溶解Ⅰ型胶原和其他骨基质蛋白。CTSK基因突变引起组织蛋白酶K在破骨细胞中表达减少，活性降低，使破骨细胞吸收功能障碍，同时患者的骨形成增加，最终引起患者的骨转换不平衡，骨形成大于骨吸收，导致肥厚性骨发育不良。
Cathepsin K抑制剂:在肥厚性骨发育不良患者中，由于CTSK基因突变导致组织蛋白酶K表达减少，患者出现骨量增加。如果人为的抑制组织蛋白酶K的活性，是否会出现类似的表现，组织蛋白酶K抑制剂就应运而生。与其他抗骨吸收的药物不同，其抑制骨吸收的同时可能会增加骨形成。Odanacatib作为Cathepsin K抑制剂中的代表，取得了充分的临床研究证据。LOFT(the Long-Term Odanacatib Fracture Trial)是一项随机对照Ⅲ期试验，目的是评估Odanacatib降低绝经后骨质疏松症妇女骨折风险的治疗效果和安全性[28]。对16 713例年龄≥65岁的女性，分别给予Odanacatib或安慰剂50 mg/周，平均随访35个月后，试验组较对照组非椎体骨折发生率降低23%，髋部骨折发生率降低47%。随访5年后，试验组腰椎与全髋骨密度分别较对照组增加11.2%和9.5%。与此同时，对LOFT中患者的心脑血管安全进行评估发现，Odanacatib会使卒中发病率增加30%，此发现导致该制剂未能进一步获批用于骨质疏松症的防治[29]。尽管Odanacatib的研究和开发因不良反应而终止，但此类产品的良好疗效已得到学术界的认可，新型制剂的研究仍值得期待。
骨硬化症与Wnt通路
骨硬化症(osteopetrosis or sclerosteosis):由成骨细胞功能异常引起的骨硬化症主要包括常染色体显性遗传骨硬化症Ⅰ型(autosomal dominate osteopetrosis Ⅰ，ADO-Ⅰ)，硬化性骨化症和Van Buchem病等。
硬化性骨化症是一种罕见的常染色体隐性遗传的进行性硬化性骨发育异常性疾病, 有关文献报道约有100例。疾病的主要特征为骨的过度增生及广泛骨硬化，患者一般身材高大，甚至出现巨人症的表现，临床特征中最显著的是进行性面部畸形和颅骨过度增长导致的口眼歪斜以及颅神经受压的表现，如面瘫、耳聋及失明。手畸形是该疾病的另一个特殊表现，包括并指、指甲发育不良或缺失。患者常见的死亡原因是颅内压增高。与骨质疏松症相比，患者骨密度增加，骨质量非常好，且不易发生骨折[30]。
Van Buchem病也是一种罕见的常染色体隐性遗传性硬化性骨病，与硬化性骨化症具有相似的临床表现，但患者的身高正常且无并指畸形[26]。
遗传学研究表明，两种疾病均由SOST基因突变引起。SOST基因高度保守，位于常染色体17q12-q21，包含2个外显子，编码硬骨素(sclerostin)[31]。硬化性骨化症由SOST基因的失活突变导致，而Van Buchem病是由于SOST基因下游52 kb片段缺失[32]。该基因的突变导致硬骨素功能缺失，使其对骨形成Wnt通路上的抑制作用减弱，骨形成过度活跃，最终引起骨骼异常增生的硬化性骨病[27]。硬骨素的产生受不同因素的影响，其中最主要的是机械负荷，甲状旁腺激素和雌激素，这些因素都对其有负向调节作用[33-34]。
硬骨素抑制剂：硬骨素由成熟骨细胞产生，会通过抑制LRP5或低密度脂蛋白受体相关蛋白6(lipoprotein receptor-related protein 6，LRP6) 同Wnt结合，进而抑制Wnt下游的信号通路，抑制骨形成。因此，阻断硬骨素会有非常强的成骨效应，这一发现促使了硬骨素抑制剂的研发。动物实验表明，SOST基因敲除小鼠(SOST-/-)较野生型小鼠骨密度、小梁骨和皮质骨的骨体积分数(bone volume/total volume，BV/TV)及骨强度均增加，其中，骨密度增加超过50%[35]；硬骨素抗体治疗去卵巢大鼠6个月，可反转雌激素缺乏1年导致的骨丢失，其骨量和骨强度也恢复至正常水平。硬骨素抑制剂对骨形成的影响在中止治疗后是可逆的[36]。McClung等[37]针对硬骨素抗体Romosozumab的安全性及有效性进行了临床研究，对419例绝经后低骨量女性，随机给予不同剂量Romosozumab(每月70、140、210 mg或每3个月140、210 mg)、阿仑膦酸钠(70 mg/周)、特立帕肽(20 μg/d)及安慰剂，连续12个月。结果显示，与对照组相比，皮下给予Romosozumab(210 mg/月)可使患者的腰椎、全髋及股骨颈骨密度分别增加11.3%、4.1%和3.7%。同时，Romosozumab还可持续降低骨吸收标志物，短暂增加骨形成标志物。其不良事件和严重不良事件的发生率与安慰剂组相似。
骨质疏松症遗传机制和靶向治疗的启示骨质疏松症属于复杂性状的遗传环境疾病。其遗传背景复杂，在过去的几十年，连锁分析、候选基因和全基因组关联研究(genome-wide association studies，GWASs)在骨质疏松症的遗传研究方面取得了重大进展，特别是通过罕见骨病发现的一些重要的致病基因，也出现在GWASs发现的60个与骨质疏松症的不同表型相关的基因中[38-41]。Estrada等[42]报道了迄今为止最大的关于GWAS的Meta分析，研究表明56个全基因组位点与BMD有关，其中32个位点是新发现的，14个位点与骨折风险有关。由罕见病研究所揭示的重要骨代谢调控通路，对阐明骨质疏松症的病理生理机制具有重要意义。除了前文中所述及的RANKL/OPG/RANK、SOST-LPR5/6-Wnt、CTSK-骨钙素(osteocalcin，OC)等信号通路外，对低磷性佝偻病研究发现的成纤维细胞生长因子23(fibroblast growth factor 23，FGF23)-肾脏-骨骼通路，进行性骨化性纤维发育不良(fibrodysplasia ossificans progressiva，FOP)研究中发现的骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)-活化素受体1(activin A receptor type 1，ACVR1) 通路，均有望为今后的骨代谢或其他疾病的诊治提供新的思路和干预靶点。
总之，“罕见病”可能蕴藏着“大道理”，随着技术的进步，将有更多的“罕见病”致病基因和发病机制被揭示，这将不断完善骨骼发生、发育、重建调控的理论基础。目前，应抓住技术进步所带来的契机，充分利用我国人口基数大，罕见病患病人数众多的资源优势，加强罕见骨骼疾病的研究，为提高骨代谢领域的理论水平和疾病诊疗水平做出贡献。
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| (收稿日期：2017-04-17) |