2. 215123 苏州，苏州大学唐仲英医学研究院血液学研究中心;
3. 215004 苏州，苏州大学骨质疏松症诊疗技术研究所
2. Hematology Center of Cyrus Tang Medical Institute, Soochow University School of Medicine, Suzhou 215123, Jiangsu, China;
3. Osteoporosis Institute of Soochow University, Suzhou 215004, Jiangsu, China
许多病理状态铁过载疾病存在骨质疏松并发症，例如血红蛋白沉着病、含铁血黄素沉着症、地中海贫血、镰状细胞疾病[1-4]；2006年Weinberg提出假说认为体内铁增加是骨质疏松症的危险因素[5]。近年来，许多研究发现绝经后女性会出现铁蓄积，且铁蓄积与骨质疏松症显著相关[6]。女性铁蓄积可能与雌激素减少相关，已有研究采用卵巢切除术 (ovariectomy，OVX) 动物模型，探讨雄性动物铁蓄积会不会骨量下降？降铁干预可否恢复骨量下降。目前这方面研究较少，本实验研究雄性铁蓄积小鼠模型骨量变化和降铁剂去铁胺 (deferoxamine，DFO) 对骨量变化的影响。
材料与方法 实验动物体内实验使用SPF级8周雄性C57小鼠 (苏州大学实验动物中心)，实验动物许可证号：SYXK (苏)2014-0030，18只小鼠分为对照组、铁蓄积组、DFO干预组，每组6只。
铁蓄积 (FAC) 组：使用枸橼酸铁铵 (ferric ammonium citrate，FAC) 腹腔注射，剂量每周0.1 g/kg，共8周[7]。
DFO干预 (FAC+DFO) 组：使用FAC腹腔注射，剂量每周0.1 g/kg，共8周，第4周FAC干预后1 h腹腔注射DFO，剂量每周0.2 g/kg[8]。
对照 (Ctrl) 组：采用腹腔注射0.9%氯化钠注射液处理每周0.1 g/kg，共8周。8周后所有小鼠麻醉处死。
血清铁蛋白检测各组小鼠相同条件饲养8周后处死并眼眶取血，酶联免疫吸附测定 (enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA) 法检测血清铁蛋白 (ferritin, FER, ABCam)，具体操作步骤按说明书进行。
骨量micro-CT评估各组小鼠处死分离单侧股骨，使用micro-CT扫描，进行股骨远端骨小梁三维形态重建和空间结构参数分析，分析参数包括：骨密度 (bone mineral density，BMD)、骨体积分数 (bone volume/tissue volume，BV/TV)、骨小梁厚度 (trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁分离度 (trabecular separation，Tb.Sp)。
细胞培养MC3T3细胞 (中科院上海细胞库) 使用包含10% FBS (Gibco)、100 U/mL青霉素 (Beyotime)、100 μg/mL链霉素 (Beyotime) 的α-MEM (Hyclone) 培养基在5% CO2、37 ℃环境培养，72 h后换液，培养3 d进行传代。
ALP活性检测MC3T3细胞以每孔1×105/mL密度接种于6孔板中。细胞24 h后贴壁加入50 mg/L抗坏血酸和10 mmol/L β甘油酸钠，FAC组培养基中加入FAC 100 μmol/L培养48 h，DFO干预组加FAC 100 μmol/L，第24小时加DFO 10 μmol/L[9]，对照组加PBS 100 μmol/L 48 h。各组48 h后每孔加入75 μL Triton X-100裂解细胞，收集上清液后用BCA试剂盒 (Beyotime Biotichnology) 测定总蛋白浓度，用碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase，ALP) 活性测定试剂盒 (Labassay) 测ALP含量。使用酶标仪测定波长为520 nm各孔的吸光度并据此计算单位蛋白浓度中ALP的相对活性。
Western blotting法检测MC3T3细胞经PBS清洗使用裂解液提取蛋白，BCA定量后取60 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，之后转移至PVDF膜，常规免疫染色[兔抗-骨形成蛋白 (bone morphogenetic protein，BMP)2，Boster；人抗-GAPDH，上海康成有限责任公司]，4 ℃过夜，TBST冲洗后二抗孵育1 h，DAB显色。
统计学方法采用统计软件SPSS19.0进行统计，采用方差分析，实验数据以均数±标准差 (x±s) 表示。P < 0.05表示差异有统计学意义。
结果 血清铁蛋白水平ELISA结果显示，FAC组与对照组相比，FAC组干预8周后FER水平明显上升；DFO干预组与FAC组相比，DFO能降低体内铁蓄积水平，差异具有统计学意义 (P < 0.05)(图 1)。
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| 图 1 铁蓄积组与对照组血清FER的比较 Figure 1 Comparison of serum FER among FAC group, FAC+DFO group and control group Ctrl：对照组; FAC：铁蓄积组; FAC+DFO：铁蓄积后DFO干预组; DFO:去铁胺；FER:去铁蛋白 |
小鼠股骨远端micro-CT检测FAC组与对照组相比，FAC组干预8周后骨小梁结构破坏、骨小梁稀疏、连续性下降; DFO干预组与FAC组相比，DFO能缓解铁蓄积造成的骨量减低 (图 2)；骨小梁空间结构参数显示：FAC组BMD、BV/TV、Tb.Th比对照组明显下降，Tb.Sp值增大，DFO干预组恢复正常，差异具有统计学意义 (P < 0.05)(表 1)。
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| 图 2 Micro-CT股骨远端骨小梁三维重建图 Figure 2 Three-dimensional reconstruction map by micro-CT at distal femoral trabecula |
| 组别 | BMD (mg/mm3) | BV/TV (%) | Tb.Th (mm) | Tb.Sp (mm) |
| Ctrl (n=6) | 104.68±8.56 | 19.92±1.92 | 0.098±0.008 | 0.172±0.133 |
| FAC (n=6) | 50.41±10.27* | 10.18±1.76* | 0.057±0.012* | 0.322±0.214* |
| FAC+DFO (n=6) | 92.72±9.62# | 17.84±1.54# | 0.085±0.010# | 0.186±0.195# |
| Ctrl：对照组; FAC：铁蓄积组; FAC+DFO：铁蓄积后DFO干预组；BMD：体积骨密度值；BV/TV：骨体积分数；Tb.Th：骨小梁厚度；Tb.Sp：骨小梁分离度；与Ctrl组比较，*P < 0.05；与FAC组比较，#P < 0.05 | ||||
对照组、FAC组、DFO干预组细胞ALP活性值分别为0.71±0.06、0.33±0.04、0.59±0.03，FAC组与对照组、DFO干预组与FAC组比较有统计学意义 (P < 0.05)(图 3)。
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| 图 3 各组细胞ALP活性比较 Figure 3 ALP activity by flow cytometry compared among FAC group, FAC+DFO group and control group Ctrl：对照组; FAC：铁蓄积组; FAC+DFO：铁蓄积后; DFO干预组; DFO:去铁胺；ALP:碱性磷酸酶; *P < 0.05 |
相比于对照组，FAC组细胞BMP2表达量降低，加入DFO后细胞BMP2表达量恢复正常 (图 4)。
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| 图 4 各组BMP2蛋白表达水平变化 Figure 4 BMP2 protein expression among FAC group, FAC+DFO group and control group BMP2:骨形成蛋白2；Ctrl：对照组; FAC：铁蓄积组; FAC+DFO：铁蓄积后DFO干预组; DFO:去铁胺 |
原发性骨质疏松症分为两型，Ⅰ型骨质疏松主要与雌激素减少相关，Ⅱ型骨质疏松主要与年龄相关。铁蓄积在Ⅰ型骨质疏松症的研究比较丰富，主要认为雌激素减少会导致女性月经排血停止造成铁蓄积 (正常女性1年可以通过月经排铁36 mg)。本研究在这一背景下，观察雄性小鼠 (排除雌激素影响) 增加外源性铁含量后骨量改变，并进一步观察降铁剂对铁蓄积雄性小鼠骨量改变的影响。
本实验在雄性小鼠中使用腹腔注射8周FAC制作铁蓄积模型，血清ELISA结果证实体内血清铁蛋白升高，micro-CT结果显示股骨远端骨量下降、骨小梁稀疏。这结果提示：雄性小鼠发生铁蓄积也可导致骨质疏松[10-11]，该现象可能和活性氧簇 (reactive oxygen species，ROS) 升高有关[7]。骨量下降有许多机制，其中BMP2是一种低分子量糖蛋白，与骨生成和再生有关，基因重组研究发现体内和体外BMP2表达能诱导骨的生成[12]，BMP2抑制可以导致骨量下降。Shen等[13]发现在Hepc1-/-铁调素缺乏铁蓄积小鼠模型中骨量下降、骨微结构破坏，BMP/SMAD通路受抑制。BMP2存在于骨基质中，对间充质干细胞 (mesenchymal stem cells，MSCs) MSCs有趋化和促进增生的作用，调节MSCs成骨分化[14]。MC3T3细胞来源于MSCs，是成骨细胞前体细胞。本研究在细胞实验中铁蓄积可抑制成骨前体细胞BMP2表达，这提示，铁蓄积在雄性小鼠中可能影响成骨形成。
铁蓄积的临床干预主要是铁螯合剂使用。本实验在铁蓄积模型中，使用降铁药物DFO干预，micro-CT结果显示DFO可以抑制铁蓄积造成的骨量下降，同时血清铁蛋白水平降低；细胞实验提示：铁蓄积导致成骨细胞ALP活性下降，DFO干预后成骨细胞ALP活性恢复，Chen等[15]在斑马鱼铁蓄积模型中使用DFO干预，结果提示DFO可以抑制铁蓄积诱发的骨量下降。已有实验证实DFO对雄性和雌性小鼠铁蓄积诱导骨量下降有抑制作用[16-17]，本实验主要研究DFO对铁蓄积雄性小鼠骨量下降成骨指标ALP和BMP表达的影响。另外，MSCs与成骨细胞形成关系密切，在成骨过程中起重要作用，Najafi等[18]研究发现DFO能促进MSCs归巢，与低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)、趋化因子受体4(chemokine receptor4，CXCR4)、趋化因子受体 (CCR-2)、金属基质蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)、金属基质蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9) 表达升高有关。Xie等[19]研究提示铁蓄积可通过ROS抑制骨髓MSCs活性，使用DFO可以缓解；此外也有研究发现DFO可促进血管生成，抑制骨量降低[20]。本实验表明铁蓄积可以抑制细胞活性，DFO干预可以缓解铁蓄积相关的骨量下降。
综上所述，雄性小鼠铁蓄积模型骨量下降，DFO能降低体内铁蓄积、缓解骨量丢失作用，可能与DFO阻断铁蓄积对成骨细胞ALP、BMP2的抑制有关。降低铁蓄积方法有可能成为铁蓄积骨质疏松治疗的补充干预新方法。
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| (收稿日期：2016-01-25) |