19世纪末，Kolliker发现一种具有骨吸收功能的细胞并将这种细胞命名为破骨细胞。破骨细胞是一种来源于CD14和CD11b阳性的前体细胞的一种多核细胞，尽管在其分化过程中受许多其他信号通路的调控，但关键的局部细胞分化信号：核因子κ B受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κ B ligand，RANKL)，目前被认为起主要作用。近年来关于破骨细胞信号通路的研究主要集中于转录因子核因子-kappa B(nuclear factor-kappa B，NF-κB)通路，磷脂酰肌醇(-3)激酶(phosphatidylinositol 3-kinases，PI3K)／丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)通路和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases，MAPK)通路，且最终都通过活化T细胞的胞质核因子1(nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1，NFATc1)而起作用，由于钙离子对NFATc1具有重要调控效应，因此RANKL介导的Ca2+-NFATc1信号轴在破骨细胞分化过程中具有重要作用[1]。TRPV4离子通道介导的钙内流调控着RANKL诱导的钙信号通路，已有研究表明瞬时感受器电位通道4(transient receptor potential 4，TRPV4)基因敲除小鼠具有明显的骨吸收障碍[2]，说明TRPV4离子通道可能作为骨吸收疾病的潜在治疗靶点，研究其在破骨细胞分化过程中的作用机制，并寻找TRPV4阻断剂抑制破骨细胞分化，对骨吸收疾病的治疗具有重要意义。
RANKL及其下游的Ca2+-NFATc1信号轴RANKL和M-CSF对破骨细胞的生成至关重要，骨髓源单核/巨噬细胞在这两种因子的刺激下分化成为成熟和具有功能的破骨细胞。在破骨细胞(osteoclast，OC)中，RANKL与 RANK结合后作用于Src蛋白，激活IP3，后者引起钙离子内流，Ca2+／钙调素(calmodulin，CaM)依赖的钙调神经磷酸酶(calcineurin，CN)产生钙震荡，钙震荡生成持久的钙离子波，激活磷酸酶，上调NFATc1，使之去磷酸化，并转位到细胞核内，与DNA发生高亲和力的结合，发挥基因调控功能，促进OC的产生[3]。钙振荡是指胞质内钙离子以浓度振荡的方式转导多种调控信息，影响OC分化、成熟和凋亡等各种过程。钙振荡常常伴随着钙池操纵性钙内流(store-operated Ca entry，SOCE)发生，由于内质网钙库的排空，使细胞膜钙通道被激活，Ca2+通过细胞膜进入胞质内，这个过程称为SOCE，钙池操纵性钙通道(store-operated channel,SOCC)是细胞膜钙通道的一种，其开放与胞内钙库的释放密切相关，在兴奋性和非兴奋性细胞中均发挥重要作用。SOCC的激活机制主要是细胞膜上受体激活后通过活化磷脂酶C(phospholipase C,PLC)产生IP3，IP3与胞内钙池上的IP3受体结合引起钙池内钙离子释放到细胞浆，从而导致胞内钙池耗竭，继而触发钙离子的大量内流。RANKL诱导破骨细胞分化过程中产生的钙震荡由破骨细胞相关受体(osteoclast-associated recepter，OSCAR)和骨髓细胞触发受体2(triggering receptor expressed on myeloid cells 2，TREME2)所起始，该两者募集脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase，syk)，激活PLCγ，产生IP3，作用于内质网，释放钙离子[4]。介导SOCE通路的功能单元主要包括两个重要的分子——位于细胞膜的钙离子通道Orai1 和位于内质网膜的钙离子感受器STIM1。STIM1作为一种“钙池信号感受蛋白”，发挥作用的结构基础主要是其N-端含有典型的与Ca2+结合的EF螺旋结构域。当钙池内钙离子浓度降低时，STIM1与Ca2+解离，构象变化并向细胞膜移动靠近，通过C-端与细胞膜上的SOCC通道蛋白Orai1的相互作用而开放钙通道，触发钙内流，故STIM1的主要功能主要是感受钙池内钙离子的浓度。而Orai1 主要是SOCC执行钙池操纵性作用的细胞膜钙通道。Orai1在细胞内C端和N端分别含有一个与STIM1结合的位点，但是C和N末端位点STIM1-Orai1结合后的行动执行不同的作用。研究表明，Orai1 通道C端反应主要阻止Orai1固定在内质网——质膜结合点，而N-末端位点的突变则削弱STIM1-Orai1结合Orai1 C-末端反应，总之，C-和N-末端与STIM1结合的位点被证实在Orai1与STIM1相互作用以及Orai1通道激活和静息中起到非常重要的作用。当钙库中Ca2+得到补充之后，STIM蛋白与Orai蛋白缓慢解离即失活，通路关闭[4]。
TRPV4离子通道TRPV4是一种非选择性Ca2+、Mg2+通道，属于瞬时感受器点位通道超家族的一员。该通道由871个氨基酸组成，最新研究表明，TRPV4可能包括6个锚定蛋白和33个氨基酸基序，后者可能参与蛋白质间相互作用。TRPV4表达十分广泛，在呼吸道内皮细胞、平滑肌细胞、动脉内皮细胞，甚至内耳毛细胞上都有表达，在骨组织中，TRPV4主要表达在破骨细胞和成骨细胞表面[5]。
TRPV4离子通道与RANKL介导的破骨细胞分化之间的联系在RANKL诱导的OC分化中，RANKL引起钙震荡，继而激活NFATc1引起的的基因转录，从而调控破骨细胞的分化。然而，该过程中所涉及的离子通道却未被深入探究。研究显示，TRPV4基因敲除的小鼠由于骨吸收障碍而导致骨硬化症[2]。在诱导的破骨细胞分化过程中，随着钙震荡信号的下降，TRPV4介导的钙内流随之增强，逐渐取代钙震荡成为细胞内主要的钙信号，从而继续促进NFATc1的激活，调控破骨细胞的终末分化。总之，TRPV4诱导的钙信号在骨重建过程中发挥重要作用，破骨细胞的分化不仅需要钙震荡，同时需要TRPV4诱导的钙内流。
最近研究显示，在猪的心血管系统中，TRPV4的激活可导致NFATc1的显著上调[5]，提示TRPV4与NFATc1有显著相关性。Alexander等[6]研究发现破骨细胞内的钙震荡并不是IL-1刺激的结果，而是RANKL诱导而产生的，并且在全基因组扫描的基础上，NFATc1在RANKL刺激下的基础上显著上调。Yang等[17]的研究发现，基因敲除G蛋白信号10的调节因子RGS 10会导致胞内钙震荡的缺失，从而使NFATc1的上调受阻，终止了破骨细胞的分化。NFATc1的过表达可以部分挽回RGS 10-/-所导致的破骨细胞分化障碍。Alexander等等[6]发现Src家族酪氨酸激酶Lyn可能是破骨细胞的负调控因子。Stotz等[8]发现TRPV4可能是一种雄性特异性骨代谢调节因子
TRPV4离子通道拮抗剂 钌红金属染料钌红是第一个被发现的对TRPV4具有较强阻滞作用的离子通道拮抗剂，该物质以电压依赖的方式，在1 μmol/L浓度下完全阻断人和小鼠的TRPV4离子通道。也有研究表明该物质也可阻断大鼠的TRPV4离子通道。除此以外，钌红也可与其他许多蛋白发生反应，如TASK、RyR1、 RyR2、RyR3、TRPM6、TRPM8、TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV5、TRPV6、TRPA1、mCa1、mCa2等[6]。
RN-1734RN-1734分离自磺胺类药物，该物质可阻断人、大鼠及小鼠的TRPV4离子通道。特别的是，它可以完全阻断由4α-PDD、RN-1747等TRPV4激动剂激活的TRPV4。RN-1734对TRPV4具有选择性。
RN-9893RN-9893是一种可口服的TRPV4阻断剂，可阻断被4α-PDD激活的人、大鼠及小鼠TRPV4通道。除此以外，RN-9893还可选择性阻断TRPV1、TRPV3 与TRPM8。在Wistar 大鼠中，RN-9893口服生物利用度(F%)大于40%，半衰期(half-life)大于40 min[9]。
辣椒平辣椒平原本是一种TRPV1阻断剂，近期研究表明它也可以在较高浓度下(15 μmol/L)阻断TRPV4。
柠檬醛柠檬醛是香茅的主要组成成分，其以电压依赖的方式阻断TRPV4通道[8]。同时，它还可以阻断TRPA1，激活TRPV1、TRPV3和TRPM8。
葛兰素史克拮抗剂(antagonists from GlaxoSmithKline，GSK)GSK是葛兰素史克公司生产的一系列和TRPV4激动剂GSK-1016790具有相似化学结构的TRPV4拮抗剂。
GSK-205在亚微摩尔浓度下可阻断猪软骨细胞TRPV4通道，并且可以阻断人体配体门控的和高渗激活的内源性瞬时表达的TRPV4通道[10]，然而其选择性尚无研究证明。
GSK-2193874是一种可口服的特异性TRPV4通道阻断剂，该药物在大鼠心衰模型中，被证明可以阻止和逆转肺水肿的发生[11]。其在大鼠体内清除率较低(7.3 ml/min·kg)，生物利用度较高(31%)，提示该药可能作为通过阻断TRPV4通道从而抑制破骨细胞分化的潜在备选药物。
其他信号通路RANK-RANKL-OPG系统是近年来被发现的与破骨细胞分化过程密切相关的细胞因子体系，包括核因子受体活化因子(RANK)及其配体(RANKL)以及骨保护素(OPG)。其中，RANK是肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor，TNFR)超家族中的一员，是由616个氨基酸组成的跨膜蛋白，RANK广泛表达于OC的前体细胞、成熟OC、软骨细胞及乳腺上皮细胞。 RANKL又称破骨细胞分化因子(osteoclast differentiation factor，ODF)，是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族成员，RANKL主要表达在活化T淋巴细胞、成骨细胞和骨基质细胞。RANK和RANKL结合后，激活一系列下游信号通路，刺激OC的分化、活化并抑制其凋亡。OPG是RANKL的另一种受体，又称为破骨细胞生成抑制因子(osteoclastogenesis inhibitory factor，OCIF)。OPG在淋巴细胞中分布于B细胞、树突状细胞和滤泡树突状细胞，由于OPG与RANKL结合后可以阻断其与RANK的结合，因此OPG可作为RANK的竞争受体，阻止RANK和RANKL结合，从而间接抑制OC的分化。可见，RANKL和OPG相互协调，通过调控RANK的激活水平来调节骨吸收的程度及骨密度。肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF)是一组与TNFR家族成员胞质区关联的接头蛋白。当成骨细胞(osteoblast，OB)膜上的RANKL与OC表面的RANK结合后，促使OC内RANK的胞内区与TRAF结合，将RANKL的信息进一步传递下去。目前已经发现的TRAF家族成员有TRAF1～7，主要介导TNF家族细胞因子信号和病原体相关分子信号(pathogen associated molecular pat terns，PAMPs)。除Ca2+-NFATc1信号轴外，目前发现OC内与RANK相关的信号转导通路主要有3条，包括NF-κB通路，PI3K／Akt通路，MAPK通路。
NF-κB通路NF-κB从属于NF-κB／Rel家族。RANKL的信号经 RANK传递给TRAF6，TRAF6则作用于NIK(NF-κB可诱导性激酶)和IKK，使I-κB发生磷酸化而降解，与NF-κB解离，暴露NF-κB的核定位序列，使NF-κB转位到核内，与靶DNA结合，发挥转录调控作用，从而促进OC的分化、激活和凋亡。在破骨前体细胞中，趋化因子2(C-X-C motif chemokine 2)可以通过NF-κB和JNK通路被RANKL所诱导，而CXCL2反过来可以促使破骨前体细胞的增生[12]。经乳过氧化氢酶处理过的破骨细胞，其TRAF6的泛素化和NF-κB信号被下调[13]。 NF-κB通路的激活也可以被胰腺炎相关蛋白(pancreatitis-associated protein，PAP)所抑制[14]。
PI3-K/Akt通路磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinases，PI3-K)是许多生命活动的关键信号分子。在破骨细胞中，TRAF6使非受体酪氨酸激酶Src激活，Src反过来刺激PI3K，激活的PI3-K使蛋白激酶Akt活化，Akt 又通过下游效应器AFX/FOXO4来抑制OC凋亡，调节OC骨架的重置和细胞迁移，从而促进其存活。含氮双膦酸盐可以通过抑制Akt的激活而抑制RANKL和巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)诱导的破骨细胞形成[14]。唾液酸结合的免疫球蛋白样凝集素15(Siglecs-15)可与免疫受体DAP12(DNAX-activation protein 12)通路协调，通过PI3K/Akt通路调节OC形成，Siglecs-15缺失可导致OC分化障碍[15]。有研究表明，IA类PI3K可通过蛋白激酶B(即Akt)诱导的囊泡转运调节骨吸收[16]。
MAPK通路丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)是一类丝氨酸／苏氨酸磷酸化激酶。Ras是一种单链GTP结合蛋白，通过胞浆中的一种GDP-GTP交换因子Sos 而活化，成为有活性的Ras-GTP，并募集丝氨酸／苏氨酸磷酸化激酶MAPKKK，使其下游的MAP 激酶的激酶(MAPKK，又称MEK)发生磷酸化而活化，再使MAPK发生磷酸化而活化。MAPK有多种形式，其中在信号转导中起主要作用的是细胞外信号调节激酶(extracellular regulated kinase，ERK)，JNK／SAPK(jun N-terminal kinase／stress-activated protein kinase)、p38MAPK等。这些激酶在RANKL-RANK的下游被激活，并能引起细胞应答，从而促进OC分化。有研究表明，穿心莲内酯可以通过阻碍ERK/MAPK通路的激活来抑制OC分化[17]，而姜黄醇可以通过抑制JNK/AP-1通路来减少RANKL诱导的OC形成[18]。新型材料十四烷基二甲基氧化胺(OA-14)可以通过抑制破骨细胞p38通路来减少钛颗粒导致的假体周围骨溶解[19]，提示OA-14可能作为新的假体材料。
前景与展望在破骨细胞分化过程中，RANKL-RANK-OPG系统发挥了关键作用，RANK下游信号通路包括NF-κB通路，PI3K／Akt通路，MAPK通路和起重要作用的Ca2+-NFATc1信号轴。TRPV4离子通道介导了钙震荡后期的外钙内流，调控着破骨细胞的终末分化，找到该通道的特异性阻断剂对骨吸收疾病的研究和治疗具有重要意义。
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| (收稿日期：2015-05-13) |