原发性肥厚性骨关节病(primary hypertrophic osteoarthropathy，PHO)，又称厚皮性骨病(pachy-dermoperiostosis)，为罕见遗传性疾病，多数呈常染色体隐性遗传，主要累及皮肤、骨骼和软组织[1]。疾病的主要临床表现包括杵状指趾、皮肤增厚、骨膜增生、多汗、关节肿痛等，少见表现有动脉导管未闭、颅缝关闭延迟、骨髓纤维化、腹泻等[2]。
近期研究发现，PHO的致病基因主要有：编码15-羟前列腺素脱氢酶(15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase，15-PGDH)的HPGD基因和编码前列腺素转运蛋白(prostaglandin transporter，PGT)的SLCO2A1基因[3-4]。目前国内外报道的患者多为男性，大多具有皮肤增厚、骨膜增生、关节肿胀等典型临床表现，然而，PHO女性患者少，临床表现相对不典型，容易漏诊，报道较少[1]。
据文献报道，杵状指趾是PHO最常见的临床表现之一。约95%~97%的杵状指趾存在复杂的继发性原因，主要与心、肺疾病，消化系统疾病和肿瘤等疾病相关[5]。明确杵状指趾的原因相对困难，疾病的治疗也面临挑战，积极寻找其病因对于进一步治疗，具有重要意义。
本研究对两例罕见的主要表现为原因不明杵状指趾的女童，进行临床表型的详细调查，并对其致病基因突变进行检测，旨在了解导致患者杵状指趾的可能机制。
对象与方法 对象先证者，女，年龄9岁3个月，主诉：发现杵状指趾8年余。先证者妹妹，年龄4岁8个月，主诉：发现杵状指趾4年余。2例患者于2017年8月就诊于北京协和医院内分泌科。患者母亲孕期平顺，2例患者均足月剖腹产，出生体质量3.0 kg左右，身长不详。患者均于6月龄出现杵状指趾，并逐渐出现掌跖多汗。否认关节肿痛、面容变丑、皮肤增厚、腹泻、胃部不适、贫血病史。既往：姐姐罹患先天性动脉导管未闭，手术治疗后好转。妹妹曾右侧锁骨骨折。家族史：父母亲非近亲婚配，体健，否认家族中类似病史。查体：先证者身高145 cm(位于同龄同性别儿童+1 SD~+2 SD)，体质量45 kg(位于同龄同性别儿童+2 SD ~+3 SD)。可见典型杵状指趾，掌跖多汗，掌部皮肤粗糙。妹妹：身高115 cm(位于同龄同性别儿童+1 SD~+2 SD)，体质量19.5 kg(位于同龄同性别儿童中位数~+1 SD)，可见典型杵状指趾，掌跖多汗(图 1)。两患儿均无面部皮肤增厚，无关节肿痛，无骨骼畸形，无紫绀，囟门已闭。患者家系图如图 2所示。
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| 图 1 先天性肥厚性骨关节病患者的临床表现 Figure 1 Phenotypes of the two PHO patients A~C:先证者：A.杵状指趾；B.双手正位相；C.胸腰椎侧位相；D~F:先证者妹妹; D.杵状指趾；E：双手正位相；F.胸腰椎侧位相 |
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| 图 2 先天性肥厚性骨关节病患者家系图及HPGD基因测序结果 Figure 2 Pedigree of the PHO family and Sanger sequencing results of the HPGD gene 测序结果提示患者存在第3外显子c.310_311delCT和第3内含子c.324+5G＞A复合杂合突变，其父母亲分别为上述突变携带者 |
先证者及妹妹血生化指标和骨密度(bone mineral density，BMD)检测结果见表 1。血气分析结果正常，无低氧血症。患者血清钙、磷、甲状旁腺素浓度在正常范围，骨形成指标碱性磷酸酶正常，骨吸收指标β-胶原降解产物符合儿童正常范围[6]，血清25OHD水平正常。患者骨密度在同龄儿童的正常范围。X线片未见掌骨及尺桡骨骨膜增生及肢端骨溶解表现，胸腰椎无侧突、后突畸形及压缩性骨折(图 1)。
| 指标 | 先证者 | 先证者妹妹 | 参考范围 |
| 血气pH | 7.396 | 7.386 | 7.35~7.45 |
| 氧分压(mmHg) | 91.8 | 102 | 83~108 |
| Ca(mmol/L) | 2.45 | 2.49 | 2.13~2.70 |
| P(mmol/L) | 1.66 | 1.73 | 1.29~1.94 |
| ALP(U/L) | 280 | 197 | 42~390 |
| β-CTX(μg/L) | 1.96 | 1.87 | [6] |
| 25OHD(μg/L) | 21.9 | 29.9 | 20~50 |
| PTH(ng/L) | 50.1 | 52.8 | 12~68 |
| LS BMD(g/cm2) | 0.702 | 0.591 | |
| LS BMD Z评分 | 0.830 | 0.730 | |
| FN BMD(g/cm2) | 0.696 | 0.561 | |
| FN BMD Z评分 | 0.110 | -0.670 | |
| TR BMD(g/cm2) | 0.568 | 0.496 | |
| TH BMD(g/cm2) | 0.685 | 0.559 | |
| Ca：钙；P：磷；ALP：碱性磷酸酶；β-CTX：β-胶原降解产物；25OHD：25羟维生素D；PTH：甲状旁腺素；LS BMD：腰椎骨密度；FN BMD：股骨颈骨密度；TR BMD：大转子骨密度；TH BMD：全髋骨密度(因为无正常女性儿童大转子和全髋部位骨密度的正常值，因此未计算上述两个部位骨密度Z评分) | |||
本研究获北京协和医院科研伦理委员会批准，在研究开始前征得患者父母同意并签署知情同意书。
致病基因检测采集先证者、妹妹及其父母外周静脉血，提取基因组DNA(采用德国QIAampDNA Blood Mini试剂盒)。采用Primer 3软件设计引物，扩增HPGD的1~7外显子及其与内含子交界区。引物序列、扩增长度及PCR反应条件见表 2。PCR扩扩增产物纯化后用荧光自动测序仪(ABI3700，美国)直接测序，测序结果与参考序列NM_000860.5比对，以确定HPGD突变位点及类型，并进一步与NCBI SNP、人类基因突变数据库(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)进行比对，排除变异位点为基因多态性位点，并确定其是否为未报道过的新突变位点。采用BioEdit(7.0.9.1)软件分析突变位点在不同物种中的保守性，采用NNSPLICE0.9(http://www.fruitfly.org/)和NetGene2 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/)软件对剪切位点突变进行致病性预测。
| 外显子 | 正向引物(5′→3′) | 反向引物(5′→3′) | 产物长度(bp) | 退火温度(℃) |
| 1 | gttacttctgctccccgtca | cagcctcagcttcagcaaat | 772 | 60 |
| 2 | gctgtgagcacacctcagaa | gcagtcttgcctttctttcg | 477 | 60 |
| 3 | gaaattcctctcatggcatagg | ccagctttctgtaacttcccttt | 327 | 60 |
| 4 | taggcaaacccaaagaatcc | ggagtctcaccacaacctttg | 572 | 59 |
| 5 | ctgagtttcacaaagctatctggt | tccacctttcatccaagtga | 341 | 59 |
| 6 | cattgttacatagctgggaggata | gccaaaccaaaagtttgaag | 425 | 58 |
| 7 | tgcctcattctttcgtttca | ccttgactgcccccaaaata | 720 | 60 |
2例患者均为婴儿期起病，主要表现为典型杵状指趾、掌跖多汗，先证者有先天性动脉导管未闭病史，两例患者均未发现心肺系统疾病、Graves病、炎症性肠病等继发性杵状指趾原因。2例患者无面部皮肤增厚、容貌变丑及关节肿痛等表现，影像学未见骨膜增生及肢端骨溶解的异常表现。
HPGD基因突变分析候选基因PCR产物Sanger测序结果提示患者存在HPGD基因第3外显子c.310_311delCT和第3内含子c.324+5G＞A的复合杂合突变(图 2)。患者父亲与母亲分别为c.310_311delCT及c.324+5G＞A携带者(图 2)。
讨论本研究采用分子诊断的方法确诊两例以杵状指趾、掌跖多汗为主要表现的PHO女性儿童患者。患者PHO表现不典型，无明显皮肤增厚、骨膜增生及关节肿痛等表现。基因检测提示患者存在HPGD基因第3外显子c.310_311delCT和第3内含子c.324+5G＞A的复合杂合突变。
PHO为罕见遗传性疾病，最早于1868年由德国Friedreic报道，以常染色体隐性和不完全外显的常染色体显性两种方式遗传，男女比例约为4.9:1[1]，2008年和2012年研究发现HPGD和SLCO2A1为该病致病基因[3-4]。上述基因突变分别影响前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)的代谢和转运，导致常染色体隐性遗传1型PHO(PHOAR1，OMIM 259100)和常染色体隐性遗传2型PHO(PHOAR2，OMIM 614441)[7-9]。HPGD基因位于HPGD基因位于4q34.1，共有7个外显子，编码266个氨基酸的15-羟前列腺素脱氢酶，主要负责在细胞内将PGE2降解为PGE-M。SLCO2A1位于3q22.1-q22.2，编码643个氨基酸的前列腺素转运蛋白，主要介导PGE2从细胞外进入细胞内[10-11]。HPGD和SLCO2A1突变均导致体内PGE2增多，PGE2可以扩张血管，促进局部组织增生，刺激成骨细胞和破骨细胞，从而导致杵状指趾、多汗、骨膜增生、肢端骨溶解等临床表现[3-4, 12]。在胎儿期，动脉导管在胎盘产生的PGE2作用下保持开放，出生后血PGE2浓度明显降低，动脉导管关闭，但是，由于PHO患者血液PGE2浓度不能迅速下降，可能导致动脉导管无法关闭[13]，本例先证者就存在动脉导管未闭而行手术治疗，这也是疾病表型的一部分。
PHOAR1和PHOAR2两种疾病亚型可以通过起病年龄、性别分布和并发症进行临床鉴别。HPGD突变患者通常起病年龄早，男女比例约为2:1[14]。SLCO2A1突变患者起病年龄较晚，多于青春期后起病，尚无关于女性患者的报道。有研究者提出性激素水平可能对PGT有影响，可以解释起病年龄和性别分布的差异[15]，但在大样本PHO患者中，未发现尿PGE2和PGE-M与性激素水平有相关性[2, 16]，因此，PHOAR1和PHOAR2患者起病年龄和性别分布存在差异的机制，有待深入研究。PHOAR1型和PHOAR2型临床表型和并发症也存在差异。PHOAR2型患者通常皮肤增厚较PHOAR1型明显，可能与PHOAR2型患者的PGE2水平更高相关[2]。PHOAR2型患者容易并发骨髓纤维化和胃肠道出血，提示PGT对造血干细胞的诱导和维持，以及黏膜稳态具有重要作用[2, 17-18]。尚未见PHOAR2型患者有动脉导管未闭的报道[14]，可能是由于SLCO2A1突变患者出生后存在其他方式降解PGE2，使动脉导管关闭，但其机制尚需进一步探索。由于本研究两例患者均为女性，出生后6个月即起病，先证者又有动脉导管未闭病史，临床推测患者可能为PHOAR1型，经致病基因突变检测，证实患者存在HPGD基因的复合杂合突变，确认患者为PHOAR1型。
随着分子遗传学的研究进展，越来越多的PHO患者获得分子诊断。研究总结的41例PHO患者全部为男性[2]，研究总结的27例PHO患者中，仅1例为女性，提示该病男性多见，但也可能女性患者临床表现较轻，容易漏诊[9]。但也有1例北京协和医院女性PHO患者出现杵状指、掌跖多汗、手掌皮肤增厚、骨膜增生和关节疼痛等典型PHO临床表现的报道[8]。本研究报道的两例患者均为女性，临床表现较轻，仅以杵状指趾及掌跖多汗为主要临床表现，1例患者有动脉导管未闭史，患者无面部皮肤增厚、骨膜增生和关节肿痛的表现，这与文献报道的女性患者的临床表现[1, 19]相似。本研究患者就诊年龄较小，也可能疾病表现较轻与病程短有关，未来尚需对患者进行长期随访。
在鉴别诊断方面，杵状指趾尚需考虑其他疾病所致的可能，包括心、肺疾病，血管性病变，炎症性肠病，Graves病等[5, 20]。本研究2例患者无上述疾病的临床表现，经过相应检查，也未见上述疾病的诊断证据。本研究先证者有动脉导管未闭病史，这可见于多种遗传性疾病，如Rubinstein-Taybi综合征、Char综合征等，上述综合征多有典型外貌畸形，通过致病基因突变检测，能够很好地进行鉴别诊断[21-22]。本研究提示，对于典型杵状指趾的患者，仍需考虑PHO的可能，进行致病基因突变检测，对于明确病因十分必要。
目前已报到的HPGD突变至少有20种(图 3，4)[3-4, 7-9, 14, 23-25]，分布在第1~6外显子、第2~4内含子区域，其中c.175_176delCT突变(p.L59VfsX8)为欧洲患者的热点突变[3, 24]。本研究发现患者存在HPGD复合杂合突变，其中c.310_311delCT突变由Erken等[7]首次报道，此突变在中国人群中被多次报道，为中国人群HPGD突变患者的热点突变位点，其可致104位后氨基酸框移突变，并产生截短蛋白(p.L104AfsX3)[2, 8]。本研究检出的另一种突变c.324+5G在人、小鼠、大鼠、牛、荷兰猪、狼等多个物种中高度保守(图 3)，在中国人群中也已被报道[9]，软件预测该突变可导致剪切位点突变，引起外显子跳跃，使得蛋白质结构改变。
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| 图 3 序列比对提示c.324+5G在多种哺乳动物中高度保守 Figure 3 Multiple alignments showed nucleotide conservation of the c.324+5G among mammals |
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| 图 4 HPGD外显子结构示意图及已报道的HPGD突变 Figure 4 Schematic view of HPGD exons and previously reported mutation information of HPGD |
在治疗方面，由于杵状指趾通常无症状，往往不需要治疗[26-27]。有关节肿痛或皮肤增厚的患者，可给予非甾体抗炎药治疗，针对PEG2的选择性环氧化酶-2抑制剂为首选，该药可抑制花生四烯酸转化为前列腺素环内过氧化物，降低PEG2水平，改善患者症状。我国大样本研究前瞻性观察41例PHO患者，给予依托考昔60 mg/d治疗6个月，发现患者皮肤增厚、杵状指趾、关节肿痛明显改善，但骨皮质增厚变化不明显，该药能否改善骨骼异常尚需长期观察[2]。另外，有研究报道对非甾体类抗炎药抵抗的患者，试用双膦酸盐或英夫利西单抗治疗，对部分患者有效[28-29]。本项研究2例患者仅有杵状指趾表现，目前无临床症状，暂未予治疗，随访观察中。
PHO为罕见遗传性疾病，女性患者尤为罕见，且临床表现不典型。本文报道2例女性PHO患儿，仅以杵状指趾和掌跖多汗为临床表现，无面部皮肤增厚、骨膜增生、关节肿痛和肢端骨溶解等表现，基因检测证实HPGD复合杂合突变为患者的致病原因。提示对于起病较早的以杵状指趾为主要表现的患者，需重视HPGD等基因突变检测，以排查PHO的可能性。
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| (收稿日期：2017-08-17) |