二甲双胍作为一种安全稳定的抗糖尿病药物被广泛用于2型糖尿病治疗。其主要通过增加肌肉内葡萄糖的无氧酵解，激活腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)信号通路增强胰岛素在肝和肌肉等组织中的敏感性，抑制肠道对葡萄糖的吸收和肝糖原异生达到增加胰岛素水平和降低血糖的作用[1]。研究发现，二甲双胍对治疗非乙醇性脂肪肝及多囊卵巢综合征等胰岛素抵抗相关疾病亦有一定帮助[2-4]。另外，应用二甲双胍联合化疗药物治疗Ⅱ期非小细胞肺癌的前瞻性研究显示其具有一定的抗肿瘤作用[5]。一项针对糖尿病患者的研究也显示二甲双胍可以降低心血管疾病的发生率[6]。近年来，二甲双胍的骨保护作用得到越来越多的关注和证实，现将其对骨代谢影响的研究进展进行阐述。
二甲双胍对成骨细胞增生、分化和矿化的影响 二甲双胍在生理糖浓度下的成骨促进作用Cortizo等[7]首次研究了二甲双胍在成骨细胞系分化中的作用，显示25.0~500.0 μmol/L二甲双胍在24 h内呈剂量依赖性促进UMR106和MC3T3细胞的增生，其中200 μmol/L促进作用最明显。并可增加MC3T3细胞Ⅰ型胶原的表达和矿化结节的形成，显著提高其碱性磷酸酶活性。Kanazawa等[8]进一步证实在MC3T3-E1成骨细胞系中，50.0 μmol/L浓度的二甲双胍可以显著增加内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)，骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)，Ⅰ型胶原(type 1 collagen)和骨钙素(bone gla protein，BGP)的表达。另有研究证实，二甲双胍能在细胞和组织水平上减少骨保护素配体(nuclear factor kappa B receptor activating factor ligand，RANKL)的表达并刺激骨保护素(osteoprotegerin，OPG)的合成。从而上调OPG/RANKL比率，抑制破骨细胞的形成和分化。因此，可通过双重作用减少骨丢失，预防骨质疏松[9]。吕娇等[10]在大鼠下颌骨细胞中加入二甲双胍(0~800 μmol/L)，结果显示一定浓度范围的二甲双胍可促进原代下颌骨细胞的增生、分化和矿化，在生理条件下提高成骨细胞的成骨能力。
在体内试验中，有研究表明二甲双胍能改善去卵巢(ovariectomized，OVX)大鼠因雌激素缺乏导致的胫骨骨小梁稀疏变薄，抑制骨溶解，甚至可以使其胫骨骨密度达到正常大鼠水平[11]。这个结果表明二甲双胍除了在体外有良好的成骨作用外，还对OVX大鼠的骨丢失具有直接的抑制作用。Pradeep等[12]在存在骨缺损的慢性牙周炎患者的牙周袋中使用1%的二甲双胍凝胶，6个月后，发现牙周探诊深度(probing depth，PD)和附着丧失水平(attachment loss，AL)等多项临床指数和影像指数均显著提高。研究显示糖尿病大鼠的种植体周围骨组织经二甲双胍干预后，OPG表达增加，得到其可改善种植体周围骨质，增强种植体骨愈合能力的结论[13]。
二甲双胍对高糖条件下成骨细胞的影响越来越多的研究表明骨骼与葡萄糖代谢密切相关，骨质疏松症被认为是糖尿病的并发症之一，称为糖尿病性骨质疏松症。实际上，一些临床研究表明，二甲双胍可降低2型糖尿病患者骨折风险[14-15]。以往研究显示晚期糖基化终产物(advanced glycation end products，AGES)的蛋白交联与成骨细胞和骨细胞的功能障碍及糖尿病性骨质疏松症相关。糖尿病患者的AGEs和同型半胱氨酸的循环水平增加，它们直接损害成骨细胞和骨细胞的功能，导致骨形成和骨重建减少[16-17]。Xu等[18]研究显示二甲双胍可以明显改善由AGEs引起的成骨细胞异常增生，并证实其逆转AGEs的致骨损害作用可能是通过下调AGEs受体引起的。由此推测，二甲双胍不仅可以有效降低糖尿病患者的血糖，还可以改善由AGEs引起的成骨异常，对糖尿病患者的骨组织起到一定的保护作用。研究显示二甲双胍在生理糖浓度下可以促进大鼠下颌骨成骨细胞的增生、分化和矿化。16.5 mmol/L高糖环境则引起二甲双胍作用改变，表现为促分化但抑制矿化[19]。有研究者推测二甲双胍可以通过局部给药的方式转移到种植体周围的骨组织中，以改善糖尿病患者的骨-种植体接触。其检测了生理糖浓度(5.5 mmol/L)和高糖浓度(16.5 mmol/L)下大鼠下颌骨成骨细胞对二甲双胍的摄取情况和大鼠有机阳离子转运蛋白(rat organic cation transporter，rOCT)的表达。结果显示，大鼠成骨细胞具有在细胞内转运二甲双胍的能力，其主要是rOCT1介导的继发性主动转运。而高糖可通过rOCT1的磷酸化提高成骨细胞对二甲双胍的摄取[20]。以此为二甲双胍用于2型糖尿病患者的种植牙局部给药以增加骨形成，从而提高临床种植牙成功率的推测提供依据。
二甲双胍对其他成骨相关细胞的成骨诱导作用 二甲双胍对间充质干细胞的成骨诱导作用以往研究证实，二甲双胍具有促进大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)向成骨细胞分化，抑制其向脂肪细胞分化的潜在应用价值[21]。近来有研究将诱导性多能干细胞来源的间充质干细胞(induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells，iPSC-MSCs)接种到磷酸钙骨水泥支架(calcium phosphate cement，CPC)上时，用10 μmol/L二甲双胍处理。结果显示，二甲双胍刺激iPSC-MSCs碱性磷酸酶的活性，增强矿化结节的形成，增加Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2，RUNX2)和成骨细胞特异性转录因子Osterix(OSX)等成骨标志物的表达。肝激酶B1(liver kinase B1，LKB1)是一种AMPK激酶，当抑制其活性时，二甲双胍诱导的AMPK激活，RUNX2的表达和核定位被逆转[22]。免疫印迹和细胞摄取试验表明，iPSC-MSCs表达功能性有机阳离子转运蛋白-1(organic cation transporter 1，OCT-1)[23]，而OCT-1是介导细胞内摄取二甲双胍的跨膜蛋白。以上结果表明，表达OCT-1的iPSC-MSCs通过诱导部分由LKB1/AMPK通路介导的成骨作用来响应二甲双胍。研究表明iPSC-MSCs比骨髓间充质干细胞具有更高的增生能力和更少的致瘤性[24-26]，因此以iPSC-MSCs为基础的组织再生领域将为口腔颌面部骨组织缺损提供新的治疗思路，同时也提示可将自体间充质干细胞联合二甲双胍作为治疗糖尿病和非糖尿病患者的牙周和骨组织缺损的一种新的治疗选择。另有研究表明，在脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs)中功能性OCTs表达是促进二甲双胍在细胞内吸收从而诱导其成骨作用的生物学先决条件[27]。未来的临床前研究有必要对功能性OCTs的表达是否可以作为预测二甲双胍成骨反应的潜在生物标志物进行探讨。
二甲双胍诱导脂肪干细胞向成骨细胞分化脂肪干细胞(adipose stem cells，ASCs)的特点是高增生活性并具有分化为成骨细胞，成软骨细胞和脂肪细胞的能力[28-29]。Smieszek等[30]研究发现，二甲双胍通过促进外源性骨形成相关蛋白如BMP-2、BGP的合成，对小鼠ASCs的促骨生成作用产生影响。其在后续研究中构建了由人体脂肪组织来源干细胞(human adipose stem cells，hASCs)、二甲双胍和SS316L不锈钢生物材料构成的三元化合物模型，表面覆盖由溶胶-凝胶法制备的SiO2/ZrO2无机复合膜，评价此生物材料在骨愈合特别是非愈合的骨缺损治疗方面的作用。这是首次将二甲双胍作为一种促进金属植入物骨诱导性能的药物，结果表明，二甲双胍可以改善SiO2/ZrO2涂层的成骨性能，证实了SiO2/ZrO2-MET涂层的体外造骨性能[31]。
二甲双胍诱导牙髓细胞向成牙本质细胞分化及矿化人牙髓细胞与间充质干细胞具有相似的基因表达和分化能力[32-33]。研究人员用不同浓度二甲双胍处理人牙髓细胞，结果显示二甲双胍以剂量依赖的形式显著激活AMPK信号通路从而诱导人牙髓细胞向成牙本质细胞分化和矿化。但此研究中不同剂量二甲双胍对人牙髓细胞的增生无影响，与以往二甲双胍对细胞增生产生影响的研究结果不一致[34]，产生差异的原因可能是实验过程不同及细胞类型不同所导致。
二甲双胍通过激活AMPK和ERK信号通路影响成骨二甲双胍可使骨细胞中的细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase，ERK-1/2)被磷酸化并呈现时间依赖性[35]。目前认为，丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路对关键区域的作用及持续时间是调节骨细胞增生与分化过程的重要环节之一，可见加入二甲双胍引起的ERK-1/2磷酸化与促进成骨细胞的生长发育密切相关。
AMPK的活化可促进成骨细胞的分化和骨钙素的表达[36-37]，抑制同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)诱导的细胞凋亡[37]，抑制氧化应激，改善糖基化终末产物导致的成骨细胞功能损伤[38]。由此说明，AMPK可能是糖尿病性骨质疏松的治疗靶点。Kanazawa等[35]在MC3T3-E1成骨细胞系中加入二甲双胍(5.5~50.0 μmol/L)后，磷酸化AMPK的表达可持续增高60 min，并引起内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthas，eNOS)和BMP-2的表达量增加，加入AMPK抑制剂后，eNOS和BMP-2表达量显著降低。但Kasai等[39]得出浓度为2 mmol/L的二甲双胍可以导致AMPK信号通路持续性磷酸化，抑制成骨细胞增生、分化和矿化的相反的结论。说明小剂量二甲双胍可能通过激活AMPK信号通路来促进成骨细胞的分化和矿化过程，大剂量则产生相反的作用。这些研究结果提示AMPK活化可能是治疗糖尿病性骨质疏松的候选方案。
展望二甲双胍作为降糖药物对于糖尿病患者的益处早已得到肯定。随着研究的深入，其在成骨方面的作用亦得到了广泛关注及证实，这种潜在的骨保护作用可能会改善由糖尿病引起的骨量减少和骨质疏松。虽然二甲双胍的一些促成骨机制仍不十分明确，但相信经过更多的探讨及大量的临床对照研究，二甲双胍将在各种骨破坏缺损相关疾病的治疗中发挥巨大的作用。
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| (收稿日期：2019-01-08) |