本课题组有关铁蓄积与骨质疏松的前期研究表明，绝经后女性骨质疏松症患者中存在铁蓄积[1-2]；铁蓄积可通过活性氧损伤导致骨质疏松症的发生和发展[3-4]。在此研究背景下，本课题组研究使用降低铁蓄积的方法防治绝经后骨质疏松。临床上降低铁蓄积的主要方法是使用铁螯合剂。去铁酮 (deferiprone，DFP) 是2011年由美国食品和药物管理局 (Food and Drug Administration，FDA) 批准在美国上市的一种可口服的铁螯合剂，与铁具有良好的亲和力，可有效地控制体内铁负荷。但是，DFP对骨代谢作用如何，目前尚未有十分全面的研究报道。本研究从DFP对成骨细胞作用的研究入手，使用不同浓度的DFP体外干预小鼠前体成骨样细胞MC3T3-E1，观察DFP对MC3T3-E1细胞增生、分化以及细胞铁代谢的作用，旨为DFP对骨代谢影响的研究提供初步实验资料。
材料与方法 主要材料与仪器小鼠前体成骨样细胞MC3T3-E1(中科院上海细胞库)；去铁酮 (美国Selleck公司)；改良型α-MEM (美国Gibico公司)；胎牛血清 (美国Gibico公司)；CCK-8检测试剂盒 (日本DojinDo公司)；Trizol (美国Invitrogen公司)；碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase，ALP) 活性检测试剂盒 (日本Labassay公司)；BCA蛋白试剂盒 (南通碧云天公司)；荧光定量PCR mix (美国Madison公司)；酶标仪 (美国Thermo公司)；荧光定量PCR仪 (美国AB applied biosystems公司)。
实验方法细胞培养：小鼠MC3T3-E1细胞常规培养于改良型α-MEM培养基 (含10%的胎牛血清、青霉素100 μg/mL和链霉素100 μg/mL)，5% CO2、37 ℃条件培养。根据细胞的培养情况每2~3 d换液1次，细胞密度长至70%~80%时进行传代。
细胞增生检测：采用CCK-8法。MC3T3-E1细胞接种于96孔板中，每孔7 000个。细胞贴壁后更换培养液同时加入终浓度为50 μg/mL抗坏血酸和10 mmol/L β-甘油磷酸钠，同时分别加入终浓度为25、50、100 μmol/L的DFP，细胞分为5组，即DMSO溶剂组、对照组 (加入不含DFP的等量培养基)，25 μmol/L DFP组、50 μmol/L DFP组、100 μmol/L DFP组。每组3个复孔。干预48 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，37 ℃孵育1 h后终止培养。在15 min内用酶标仪测定450 nm波长的各孔吸光度 (A) 值。
ALP活性检测：MC3T3-E1细胞接种于6孔板中，每孔1×105个。细胞贴壁后更换培养液并加入终浓度为50 μg/mL抗坏血酸和10 mmol/L β-甘油磷酸钠，同时分别加入终浓度为25、50、100 μmol/L的DFP，细胞分为4组，即对照组 (加入不含DFP的等量培养基)，25 μmol/L DFP组、50 μmol/L DFP组、100 μmol/L DFP组。每组3个复孔。培养10 d后，各孔加75μL Triton X-100裂解细胞，收集上清液，用BCA试剂盒测定总蛋白浓度，用ALP活性测定试剂盒测定ALP含量。用酶标仪测定520 nm波长的各孔的吸光值 (A值)，根据测得A值计算单位蛋白浓度中ALP的相对活性。
实时定量PCR检测：采用实时定量PCR 2-△△CT法。MC3T3-E1细胞接种于6孔板中，每孔1×105个。细胞贴壁后更换培养液并加入终浓度为50 μg/mL抗坏血酸和10 mmol/L β-甘油磷酸钠，同时分别加入终浓度为25、50、100 μmol/L的DFP，细胞分为4组，即对照组 (加入不含DFP的等量培养基)，25 μmol/L DFP组、50 μmol/L DFP组、100 μmol/L DFP组。每组3个复孔。干预72 h后，使用Trizol试剂常规提取细胞总RNA，经反转录成cDNA。PCR反应体系为20 μL，反应条件：95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环，同时追加溶解曲线反应检测引物特异性。转铁蛋白受体 (TfR) 引物序列，上游：5′-GGCTACCTGGGCTATTGT-3′，下游：5′-CACGA GGAGTGTATGTATTCTG-3′；内参基因GAPDH引物序列，上游：5′-CCTGGAGAAACCTGCCAAGT A-3′，下游：5′-TCATACCAGGAAATGAGCTTGAC-3′。使用2-△△CT法计算TfR PCR产物的相对值，并使用Step OneTM软件V 2.1进行分析。
统计学方法实验中测定结果重复3次，采用统计分析软件SPSS17.0进行分析，实验所得数据用均数±标准差 (x±s) 表示，采用单因素方差分析 (One-way ANOVA) 进行检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
结果 细胞增生检测结果随着DFP干预浓度的增加，A值逐渐降低。DMSO溶剂组、对照组 (0 μmol/L) 和DFP 25、50、100 μmol/L组A值分别为1.36±1.10、1.41±0.09、0.78±0.06、0.68±0.03、0.46±0.01。DFP各浓度组与对照组 (0 μmol/L) 比较，差异有统计学意义 (P < 0.05)(图 1)。
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| 图 1 不同浓度DFP对MC3T3-E1细胞增生的影响 Figure 1 Effects of various concentrations of DFP on proliferation of MC3T3-E1 cells DFP：去铁酮；与对照组 (0 μmol/L) 比较，*P < 0.05 |
随着DFP干预浓度的增加，ALP活性指标逐渐降低。对照组 (0 μmol/L) 和DFP 25、50、100 μmol/L组ALP活性值分别为0.83±0.05、0.75±0.04、0.64±0.03、0.51±0.03。DFP各浓度组与对照组 (0 μmol/L) 比较，差异有统计学意义 (P < 0.05)(图 2)。
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| 图 2 不同浓度DFP对MC3T3-E1细胞ALP活性的影响 Figure 2 Effects of various concentrations of DFP on ALP activity of MC3T3-E1 cells DFP：去铁酮；ALP：碱性磷酸酶；与对照组 (0 μmol/L) 比较，*P < 0.05 |
随着DFP干预浓度的增加，TfR mRNA表达量逐渐升高。对照组 (0 μmol/L) 和DFP 25、50、100 μmol/L组表达比分别为1、1.16±0.05、1.32±0.06、2.30±0.11。DFP各浓度组与对照组 (0 μmol/L) 比较，差异有统计学意义 (P < 0.05)(图 3)。
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| 图 3 不同浓度DFP对MC3T3-E1细胞TfR mRNA表达的影响 Figure 3 Effects of various concentrations of DFP on expression of TfR mRNA in MC3T3-E1 cells DFP：去铁酮；TfR：转铁蛋白受体；与对照组 (0 μmol/L) 比较，*P < 0.05 |
MC3T3-E1细胞是一种小鼠前成骨细胞株，具有在抗坏血酸和β-甘油磷酸钠的作用下单一定向成骨细胞分化的各种生物学特征，被广泛应用于成骨细胞的相关体外研究中[5]。ALP是成骨细胞分化成熟的标志酶，一般认为，ALP活性越高，成骨细胞分化越趋成熟。TfR是细胞膜上的一种重要的铁摄取通道蛋白，其基因表达水平与细胞内铁离子浓度呈负相关，即其表达水平越高细胞内铁离子浓度越低，因此通过检测TfR可间接判断细胞内铁离子水平[6-7]。
在本研究中，使用DFP体外干预MC3T3-E1细胞48 h，细胞增生检测结果显示，随着DFP浓度的增加，细胞的增生逐渐下降；在MC3T3-E1细胞培养7 d即ALP分泌高峰时测定了ALP的活性，结果显示，随着DFP浓度的增加，细胞ALP的活性逐渐降低；DFP细胞干预72 h后，荧光定量PCR结果显示，随着DFP干预浓度增加，TfR mRNA的表达逐渐增加，提示细胞内铁离子逐渐减少因铁被DFP螯合。以上结果提示在本实验浓度内DFP可抑制MC3T3-E1细胞的增生和分化，螯合细胞内的铁离子。
2003年Suarez等[8]用去铁酮干预成骨细胞MG-63，发现高剂量的去铁酮 (180~240 μmol/L) 可抑制1，25OHD3引起的骨钙素分泌。本实验的研究结果与其相似，同样提示DFP对MC3T3-E1细胞的部分生物学活性有抑制作用。本研究组认为，这种抑制作用可能与DFP螯合细胞内的铁有关。DFP是一种可透膜的铁螯合剂，可有效螯合细胞内的铁离子。铁是细胞重要的微量元素，是细胞色素和某些呼吸酶的组成成分，细胞内铁的缺乏会导致细胞障碍。因此，在DFP的铁螯合作用下，MC3T3-E1细胞的部分生物学活性出现明显下降。
本实验是铁螯合剂DFP对成骨细胞作用的初步研究，实验指标简一，没有考虑到复杂的体内环境，这是本研究的局限。DFP对骨质疏松防治的意义究竟如何，尚需全面的研究探讨。
综上所述，本实验发现，DFP可能通过螯合小鼠前成骨细胞MC3T3-E1的铁离子抑制其增生和分化。本实验是DFP对成骨细胞作用的初步研究，为进一步探讨DFP对绝经后骨质疏松的作用提供了部分实验资料。
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| (收稿日期：2016-09-13) |