先天性无痛无汗症(congenital insensitivity to pain with anhidrosis，CIPA，OMIM 256800)，又称遗传性感觉和自主神经病变Ⅳ型(hereditary sensory and autonomic neuropathy type 4，HSAN4)，是极其罕见的常染色体隐性遗传性疾病，该病在日本人的患病率为1：600 000~950 000^[1]，由Swanson^[2]于1963年首次报道。CIPA主要临床表现为痛觉减退、无汗、反复发热、自我伤害行为、反复无痛性骨折、Charcot关节，伴或不伴有心理障碍^[3]。

近年来，研究发现CIPA的致病基因主要是神经营养性酪氨酸激酶受体1基因(neurotrophic tyrosine kinase receptor type 1，NTRK1)，其编码神经生长因子(nerve growth factor，NGF)的高亲和力受体^[4]。迄今已经报道了79种 NTRK1致病突变(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)，其中多数报道来自日本和以色列等国家^[5]。2010年NTRK1突变导致的CIPA病例在我国首次被报道^[6]，此后又有约20例患者临床诊断为CIPA，但仅有7例通过分子诊断得以确诊^{[7, 8, 9, 10, 11]}。此外，CIPA患者的骨骼病变特点、骨转换生化指标、骨密度及骨骼影像学表现，并未被充分研究及认识。本研究详细分析1例以早发、反复无痛性骨折为主要临床表现的CIPA患者的表现型特点，检测患者及其父母的NTRK1基因突变，以了解疾病致病机制。

患儿，男，年龄5岁8个月，因“反复骨折4年”，于2015年10月就诊北京协和医院内分泌科。患者为第一胎第一产，母亲孕期平顺，足月顺产，出生体质量3.4 kg，身长不详。患者7月龄起反复高热，多种临床检查未发现发热原因，抗生素治疗无效，物理降温体温可下降。高热时患者无汗，皮肤干燥，输液或抽血检查发现患者疼痛缺失。患儿1岁8个月开始走路，2岁时发生第一次轻微外力下骨折，由于骨折为无痛性，患者骨折后仍然能够行走。此后轻微外力下反复骨折4次，主要发生在左侧跟骨、胫骨、股骨。患儿5岁时，家长发现其左侧踝部肿胀，影像学检查未见骨折，提示跟骨骨髓炎表现。家族史：父母非近亲婚配，否认类似疾病病史。查体：身高105 cm(-3SD~-2SD)，体质量18.5 kg(-1SD~中位数)，未见舌及黏膜咬伤、溃疡，无牙齿缺失，巩膜不蓝，关节韧带无松弛，未见鸡胸、串珠肋，无脊柱、四肢等弯曲畸形。

血生化检测显示，血红细胞沉降率 12 mm/h(参考值0~20 mm/h)，肝肾功能正常。血钙 2.38 mmol/L(参考值2.13~2.70 mmol/L)，血磷 1.68 mmol/L(参考值1.29~1.94 mmol/L)，骨形成指标血清总碱性磷酸酶(total alkaline phosphatase，TALP)372 U/L(参考值58~390 U/L)，25羟维生素D(25-hydroxyvitamin D，25OHD) 22.9 ng/mL(参考值20~50 ng/mL)，全段甲状旁腺素(intact parathyroid hormone，PTH)21.8 pg/mL(参考值12~65 pg/mL)，均在正常范围内。骨吸收指标血清β-胶原降解产物(C-terminal telopeptide of type Ⅰ collagen，β-CTX)1.72 ng/mL(参考值0.260~0.512 ng/mL)，轻度高于正常儿童参考范围。骨骼X线片可见四肢骨折部位肥厚性骨痂。双能X线吸收检测法(GE Lunar DXA，USA)测定骨密度提示L_2-4骨密度为0.555 g/cm²(Z值= -1.8)，股骨颈骨密度0.576 g/cm²(Z值=0.9)。本研究方案符合北京协和医院科研伦理委员会要求，在研究开始前，患者父母同意参加本研究并签署知情同意书。

采集患者及其父母外周静脉血，提取基因组DNA(采用QIAampDNA Blood Mini试剂盒，德国)。采用Primer 3设计引物，扩增NTRK1种的1~17外显子及其与内含子交界区。引物序列、产物长度及反应条件见表 1。PCR反应体系共30 μL：Taq mix 15 μL、上下游引物各1 μL、基因组DNA 2 μL和ddH₂O 11 μL。PCR反应条件为：预变性95 ℃×5 min；变性95 ℃×30 s；退火30 s；延伸72 ℃×20~60 s，循环35次；总延伸72 ℃×10 min。PCR扩增产物纯化后用荧光自动测序仪(ABI3700，美国)测序，测序结果与参考序列NM_002529.3 比对，以确定NTRK1突变位点及类型(表 1)。并进一步与NCBI SNP、人类基因突变数据库(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)和遗传性周围神经病变突变数据库(http://www.molgen.ua.ac.be/CMTMutations/Mutations/Mutations.cfm)进行比对，排除变异位点为基因多态性位点，并确定其是否为未报道过的新突变位点。采用BioEdit(7.0.9.1)软件分析突变位点在不同物种中的保守性，另外采用Polyphen 2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)和SIFT(http://sift.jcvi.org/)软件对发生错义突变的蛋白进行致病性预测。

患者幼年起病，主要表现为早发、反复轻微外力下无痛性骨折，主要骨折部位是四肢，伴有无汗、反复高热及痛觉减退。患者血清骨吸收指标轻度升高，腰椎骨密度略低于性别、年龄匹配的儿童正常参考值，X线片可见骨折部位肥厚性骨痂(图 1)。

图 1 先天性无痛无汗症患者的影像学表现 Fig 1 Radiological findings in patient with CIPA A：头颅侧位相；B：胸腰椎侧位相；C：骨折部位可见肥厚性骨痂；D：跟骨骨髓炎；E：无特殊面部表现; CIPA:先天性无痛无汗症

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Sanger测序提示患者NTRK1基因存在复合杂合突变：第7内含子c.IVS7-33T＞A和第17外显子c.2281C＞T突变(图 2)。患者父亲与母亲分别为c.IVS7-33T＞A及c.2281C＞T携带者。

图 2 先天性无痛无汗症患者家系图及NTRK1基因测序结果 Fig 2 Pedigree of the CIPA family and Sanger sequencing results of the NTRK1 gene 测序结果提示NTRK1复合杂合突变：第7内含子c.IVS7-33T＞A和第17外显子c.2281C＞T；父母亲为突变基因携带者；CIPA：先天性无痛无汗症

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CIPA为极其罕见的常染色体隐性遗传性疾病，本研究确诊1例以早发反复轻微外力下无痛性骨折，伴有痛觉减退、无汗、反复发热为表现的CIPA儿童患者。患者骨吸收指标轻度增高、腰椎骨密度稍降低，骨折部位有肥厚性骨痂形成。分子遗传学分析提示NTRK1基因复合杂合突变(c.IVS7-33T＞A和c.2281C＞T)为本例患者的致病原因，c.IVS7-33T＞A为分支位点突变，可导致第7内含子剪切异常。c.2281C＞T为错义突变，导致761位精氨酸变为色氨酸(p.Arg761Trp)，该位点精氨酸在人、金丝猴、恒河猴、狗、牛、马、荷兰猪、大鼠、小鼠中高度保守(图 3)。Polyphen 2(分值=0.994) 和SIFT(分值=0.01)预测p.Arg761Trp有致病性。上述两种突变不是多态性位点，在国外CIPA患者中均已有其致病性报道^{[12, 13, 14, 15]}。CIPA属于遗传性感觉和自主神经病变4型，NTRK1为其主要致病基因，但近年报道神经生长因子(nerve growth factor，NGF)、白血病抑制因子受体α编码基因突变也可导致CIPA^{[16, 17]}。NTRK1基因位于1q21-22，编码NGF的高亲和力受体。NTRK1共有17个外显子和16个内含子，第1外显子编码信号肽和第1个半胱氨酸富集区，第2~4外显子分别编码3个亮氨酸丰富的模体区，第5外显子编码第2个半胱氨酸富集区，第6~7外显子及第8外显子分别编码第1和第2个免疫球蛋白样的模体区，第10和11外显子编码跨膜区，第12~17外显子编码细胞内区域(图 3A)。NGF与NTRK1的免疫球蛋白样模体区结合后，NTRK1发生自体磷酸化，通过MAPK通路促进交感神经和部分自主神经的生长和分化。NTRK1基因在直径较小的无髓纤维(C类纤维)及有髓纤维(A类纤维)、支配汗腺的交感后胆碱能神经元上均有表达^[18]。神经组织活检提示，CIPA患者出现A类纤维部分缺失、C类纤维完全缺失、交感后胆碱能神经元缺失，这解释了患者痛觉减退和无汗症状。

图 3 NTRK1突变位点在物种中的保守性 Fig 3 Sequence conservation of mutation in NTRK1 (Arg761) in species A：NTRK1外显子及蛋白质结构示意图,带下划线部分字体提示本患者的突变情况；B：761位精氨酸在多个物种中高度保守；SP：信号肽；CC-1和CC-2：第1个和第2个半胱氨酸富集区；LRMs：亮氨酸丰富的模体区；Ig-1和Ig-2：第1个和第2个免疫球蛋白样的模体区；TM：跨膜区；TK：酪氨酸激酶

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反复骨折为CIPA患者常见临床表现之一，但是骨折特点、骨骼影像学表现、骨转换指标、骨密度的评估尚未得到充分重视。日本分析的91例CIPA患者，共发生骨折116次，其中105次骨折(91%)发生于下肢，骨折常发生于1~7岁，尤其是4~6岁，提出深感觉减退、触压觉阈值升高、心理障碍可能是骨折的主要原因^[5]。骨折部位出现肥厚性骨痂的原因尚不明了，有研究者认为骨组织受自主神经和感觉神经支配，其神经元有NTRK1表达，如果NTRK1突变，骨折部位神经支配减少，可能影响骨折愈合过程，导致肥厚性骨痂的形成^{[19, 20]}。部分研究报道CIPA患者血清骨转换生化指标升高，但骨活检未发现明显异常^[21]。CIPA患者反复骨折的具体机制及骨骼病变情况，还有待深入研究。

在鉴别诊断方面，儿童反复骨折还需要考虑以下疾病的可能：成骨不全症、致密性成骨不全症、Hajdu-Cheney综合征、低磷佝偻病、青少年特发性骨质疏松症、骨硬化症等^[22]。肥厚性骨痂形成需要考虑成骨不全症Ⅴ型的可能，后者为常染色体显性遗传，除了反复骨折、肥厚性骨痂外，还有桡骨小头半脱位、前臂骨筋膜钙化等表现，其致病基因为IFITM5^[23]，通过致病基因突变检测，能够很好地进行鉴别诊断。

目前已报道的NTRK1突变有79种，分布于NTRK1整个区域，多数突变位于12~17外显子区。本研究发现的NTRK1基因第7内含子IVS7-33T＞A突变在日本人群中已有报道^[12]，为日本CIPA患者第二常见突变，在其他种族、中国人群中也有报道^{[9, 13, 14]}。NTRK1第7内含子IVS7-33T＞A突变使分支位点第4个核苷酸由T突变为A，体外实验证实c.IVS7-33T＞A导致第7内含子异常的剪切^[24]。第6~8外显子编码免疫球蛋白样结构域，第7内含子的异常剪切，影响NGF与NTRK1结合。本患者第17外显子c.2281C＞T突变在国外多种族中也有报道^{[14, 15]}，但该突变在中国人群是首次被识别，其导致Arg761Trp，761位精氨酸在多个物种中高度保守，软件预测Arg761Trp为致病性突变，将明显影响细胞内信号传导。包括本例患者，我国目前经分子诊断确诊的CIPA患者共有8例 ^{[6, 7, 8, 9, 10, 11]}，检出11种NTRK1突变，其中9种突变位于12~17外显子，该部位编码NTRK1细胞内区域，对于细胞内信号传导发挥重要作用。

CIPA的表现型和基因型的相关性仅有少数研究，结果提示CIPA表现型无明显异质性，部分研究显示携带c.2303C＞T(p.Pro768Leu)突变的患者表型较轻，患者存在部分痛觉，无明显心理及智力障碍^{[12, 25]}。目前我国8例基因诊断的CIPA患者的表型及基因型详见表 2。所有患者均表现为无汗、反复高热、痛觉减退，6例患者有自伤、自残行为，4例患者反复骨折，由于样本量较小，难以分析疾病表型与基因型间的关系。

CIPA尚无有效的治疗方法。夏天需注意降温，减少反复高热的发生。需加强防护，减少患者自伤、自残行为。反复骨折是疾病严重而危险的并发症，CIPA患者应注意避免跌倒，减少骨折发生^[5]。有报道1例31岁CIPA患者接受氯膦酸盐(400~800 mg/d)治疗7年，患者骨密度增加^[21]，但是骨折风险是否下降尚不明确。

综上，CIPA是极其罕见的常染色体隐性遗传性疾病，患者以早发反复无痛性骨折、无汗、痛觉减退为主要临床表现。骨吸收生化指标轻度升高，骨密度轻度降低，骨折部位肥厚性骨痂是其骨骼病变的主要特点。NTRK1突变是导致CIPA的主要分子机制。对于幼年起病、反复骨折,无痛无汗的患者，应重视CIPA的可能。