进行性骨干发育不良症(progressive diaph-yseal dysplasia，PDD，OMIM 131300)是一种罕见的常染色体显性遗传性骨病，迄今仅报道300余例[1]。该病最早于1922年由Camurati明确为遗传性骨病，1929年由Engelmann首次报道，亦被称为Camurati-Engelmann病[2]。PDD患者以四肢疼痛、乏力、肌肉无力、跨阈步态为主要表现，骨骼X线片以长骨骨皮质局部增厚、硬化, 骨小梁粗乱为特点，亦可见颅骨和骨盆受累[3-4]。
近年来，研究发现TGFB1是PDD的致病基因[5]。TGFB1位于19q13，编码转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)，TGF-β1在骨基质中高度表达，具有调节细胞增生、迁移、分化、凋亡作用[6]。TGF-β1对骨骼具有复杂调节作用：一方面促进间充质干细胞增生、分化为骨母细胞，但抑制成骨细胞成熟、矿化；另一方面促进破骨细胞生成，但抑制破骨细胞分化，具有促进骨吸收作用[7]。
PDD临床表现具有高度异质性，诊断困难，明确致病基因突变有利于患者获得正确诊断和及时治疗。然而，目前国内尚缺乏关于PDD表现型和致病基因突变的大样本研究。本研究总结1例PDD患者临床特点，分析其致病基因突变，旨在提高对罕见遗传性骨病PDD的认识。
对象与方法 对象患儿，男，2岁11月，主诉：走路摇摆1年，于2017年8月就诊于北京协和医院内分泌科。患儿系第四胎第二产，母孕期平顺，足月剖腹产，出生体质量3.75 kg，身长51 cm，1岁会走路。患儿1岁开始出现步态摇摆、四肢乏力，否认骨痛、骨折史。个人史无特殊。家族史：父母非近亲婚配，否认类似患者。查体：身高105 cm，体质量15 kg(分别位于同年龄、同性别儿童+2 SD~+3 SD，+1 SD ~+2 SD)，中等体型，四肢纤细，跨域步态，未见明显骨畸形。
本研究经北京协和医院伦理委员会批准，研究前征得患者及家属同意，并签署知情同意书。
临床特点评估采集患者清晨空腹静脉血。由北京协和医院检验科采用自动检测仪检测血常规、红细胞沉降率、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、肌酐(creatinine，Cr)、肌酸激酶(crea-tine kinase，CK)、超敏C反应蛋白(high-sen-sitivity C-reactive protein，hsCRP)、血钙(cal-cium，Ca)、磷(phosphate，P)，骨形成指标碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)浓度。采用电化学发光免疫分析仪(E170; Roche Diagnostics, 瑞士)检测骨吸收指标Ⅰ型胶原C端肽β降解产物(β-cross-linked carboxy-terminal telopeptide of type Ⅰ collagen，β-CTX)、全段甲状旁腺素(parathyroid hormone，PTH)、25羟维生素D(25-hydroxyvitamin D，25OHD)浓度。采用双能X线吸收仪(Lunar Prodigy Advance, GE Healthcare, 美国)测量腰椎及髋部骨密度，根据中国正常儿童同年龄、同性别骨密度参考值[8]，计算Z值。完成头颅、胸腰椎、双侧尺桡骨和股骨X线片。
TGFB1基因突变检测采集先证者及父母外周静脉血，提取基因组DNA(QIAampDNA Blood Mini试剂盒，德国)。采用Primer 3软件设计引物(表 1)，扩增TGFB1的1~7所有编码外显子、外显子和内含子交界区及5'和3'侧翼序列。PCR扩增产物纯化后行Sanger测序(荧光自动测序仪，ABI3700，美国)，并与参考序列NM_000660.5比对，确定TGFB1突变位点及类型。采用Polyphen2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)进行保守性分析。
| 外显子 | 引物名称 | 引物序列(5′→3′) | 长度(bp) | 退火温度(℃) | 产物长度(bp) |
| Exon 1 | TGFB1-1F | FCCCACGCGAGATGAGGAC | 18 | 63 | 1 464 |
| TGFB1-1R | GCCAGTTTCTTCTGCCAGTC | 20 | |||
| Exon 2 | TGFB1-2F | GAGACTGACTCCACCCCAGA | 20 | 61 | 334 |
| TGFB1-2R | TTGGTCACAGCTCACCCTCT | 20 | |||
| Exon 3 | TGFB1-3F | GGTGGCTGTCTGAGAGGGTA | 20 | 60 | 349 |
| TGFB1-3R | GAGAGGGGTCCTAGGCAAAG | 20 | |||
| Exon 4 | TGFB1-4F | GGTTTGCTCCTTCCTTCCTC | 20 | 60 | 306 |
| TGFB1-4R | AGTGAACCCTGCTTTGGTGT | 20 | |||
| Exon 5 | TGFB1-5F | CGCCCCACTTATCTATCCCTC | 21 | 60 | 379 |
| TGFB1-5R | TCTTACACCCAGACCTCATCCC | 22 | |||
| Exon 6 | TGFB1-6F | GGGCATGTGGCTTCTATGGTGG | 22 | 58 | 276 |
| TGFB1-6R | CCTCTTCCTCCGTCCTGGCTC | 21 | |||
| Exon 7 | TGFB1-7F | GACAGGTGGGGAGAGACAGA | 20 | 60 | 957 |
| TGFB1-7R | CTGGTCTCAAATGCCTGGAT | 20 |
患者血常规、红细胞沉降率、hsCRP、CK、ALT、Cr、Ca、P、ALP、PTH均处于儿童正常参考范围内。患者血清25OHD浓度为22.0 μg/L，提示维生素D不足。血清β-CTX浓度为2.33 μg/L，高于儿童正常上限。患者骨密度显著降低：股骨颈骨密度0.406 g/cm2(Z值-3.9)，腰椎2-4骨密度0.490 g/cm2(Z值-0.4)(表 2)。头颅侧位相可见颅底增厚、硬化；胸腰椎侧位相未见明显异常；双尺桡骨、股骨正位相见骨皮质局部增厚、硬化，骨小梁粗乱，相应髓腔狭窄，亦可见髂骨和坐骨支局部硬化(图 1)。
| 患者结果 | 正常参考范围 | |
| 身高(cm) | 105(+2 SD~+3 SD) | - |
| 体质量(kg) | 15(+1 SD~+2 SD) | - |
| WBC(×109) | 8.06 | 3.5~9.5 |
| RBC(×1012) | 5.01 | 4.0~5.5 |
| HGB(g/L) | 135 | 120~160 |
| PLT(×109) | 317 | 100~350 |
| ESR(mm/h) | 7 | 0~15 |
| hsCRP(mg/L) | 0.44 | 0~3.00 |
| CK(U/L) | 67 | 24~195 |
| ALT(U/L) | 8 | 9~50 |
| Cr(umol/L) | 18 | 18~88 |
| Ca(mmol/L) | 2.52 | 2.13~2.70 |
| P(mmol/L) | 1.85 | 1.29~1.94 |
| ALP(U/L) | 244 | 42~390 |
| β-CTX(μg/L) | 2.33 | 0.21~0.44 |
| 25OHD(μg/L) | 22.0 | 30~60 |
| PTH(ng/L) | 27.3 | 12~65 |
| FN-BMD(g/cm2) | 0.406 | - |
| FN-BMD Z值 | -3.9 | - |
| LS-BMD(g/cm2) | 0.490 | - |
| LS-BMD Z值 | -0.4 | - |
| WBC:白细胞；RBC:红细胞；HGB:血红蛋白；PLT:血小板；ESR:红细胞沉降率；hsCRP:超敏C反应蛋白；CK:肌酸激酶；ALT:丙氨酸氨基转移酶；Cr:肌酐；Ca:血钙；P:血磷；ALP:碱性磷酸酶；β-CTX: Ⅰ型胶原C端肽β降解产物；25OHD: 25羟维生素D；PTH:甲状旁腺素；FN-BMD:股骨颈骨密度；LS-BMD:腰椎骨密度 | ||
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| 图 1 进行性骨干发育不良症患者影像学表现 Figure 1 Imaging features of the PDD patient A.头颅侧位像：颅骨底板增厚、硬化(箭头)；B.胸腰椎侧位像：未见明显异常；C. D. E.双侧尺桡骨、股骨正位像：骨皮质局部增厚、硬化，骨小梁粗乱，髓腔狭窄，股骨正位像亦可见髂骨、坐骨支局部骨质硬化(箭头) |
患者存在TGFB1基因第4外显子c.652C＞T杂合错义突变，导致TGF-β1第218位精氨酸被半胱氨酸替换(p.R218C)。父母均未发现携带该突变，为新生突变(de novo mutation)(图 2)。该突变位点在人、小鼠、大鼠、猪、牛、马等多个物种中高度保守(图 3)。
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| 图 2 进行性骨干发育不良症患者家系图及TGFB1基因测序结果 Figure 2 Pedigree of the PDD family and Sanger sequencing results of the TGFB1 gene PDD:进行性骨干发育不良症 |
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| 图 3 突变位点p.218R在哺乳动物中保守性分析 Figure 3 Conservation of the p.218R among mammals |
根据患者典型临床特征，结合基因检测结果，明确诊断为PDD，给予15 mg/d起始剂量的泼尼松进行试验性治疗，同时补充钙剂300 mg/d，维生素D 1 000 IU/d，目前正在随访观察中。
讨论PDD是一种罕见的单基因遗传性骨病，本研究患者自幼起病，以跨域步态、四肢乏力为主要临床表现，以四肢长骨、颅骨、骨盆局部骨质增厚硬化，骨小梁粗乱为影像特点，基因检测证实TGFB1基因第4外显子c.652C＞T突变为本例致病原因。
PDD常常自幼起病，临床表型多样。比利时学者总结100例PDD患者，发现四肢疼痛、跨阈步态和肌肉无力是常见症状，分别占68%、48%和39%[5]。患者可因颅底硬化出现视力、听力下降及面瘫症状[9]。亦有研究报道PDD患者可出现青春发育延迟[10]。本例患者病程短，主要表现为跨阈步态和四肢乏力，无骨痛，有颅底局灶性骨骼硬化，但尚无视力及听力异常。生化检查，PDD患者可有红细胞沉降率增快、血红蛋白降低、骨转换指标升高[6, 9, 11]。本例患者β-CTX较同年龄儿升高，提示骨转换活跃，骨吸收增加。由于骨吸收增加，骨形成和骨吸收脱偶联，PDD患者骨密度显著降低，本例患者骨密度明显低于同年龄同性别儿童，与既往研究结果相同[6]。此外，PDD患者多存在维生素D不足，考虑可能与患者肌肉无力，活动较少相关[10, 12]。影像学方面，以往研究显示，94%患者有典型四肢长骨受累表现：四肢管状骨皮质对称性、进行性增厚，骨干不同程度增粗，骨髓腔狭窄或闭塞，但不侵犯骨骺；63%患者有骨盆受累表现：盆骨局部骨皮质增生、硬化；54%患者有颅骨受累表现：内外板增厚，板障狭窄甚至消失，颅底骨皮质增生、硬化，致使颅底孔径缩窄，但颅缝不受侵袭[5, 9]。本例患者影像学特点与之相符。
TGFB1基因突变是PDD的主要致病原因，该基因具有7个外显子，转录和翻译后形成TGF-β1前体复合物，包括信号肽、潜活相关肽(latency associated peptide，LAP)和成熟TGF-β1。在信号肽作用下，TGF-β1前体复合物分泌到细胞外。在胞外基质中经酶解后，产生LAP和TGF-β1组成无活性的环状复合物，该复合物通过LAP上二硫键相连形成二聚体。当整合素与LAP中的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸结构域相结合后，环状复合物二聚体解离，成熟TGF-β1被激活，从而发挥其生物学效应[13]。目前已报道12种导致PDD的TGFB1突变类型，根据对蛋白质影响分为三大类(图 4)：突变位于第1外显子区域，包括信号肽区域的亮氨酸插入(p.L10_L12dup、p.L10_L13dup)和LAP的N末端错义突变(p.Y81H)，导致TGF-β1前体复合物分泌到细胞外受阻，大量异常TGF-β1在胞内聚集，启动细胞的增强转录反应[14]；突变位于第2外显子区域，LAP的N末端错义突变(p.R156C、p.E169K)，引起局部电子异常交换，破坏环状复合物二聚体稳定性，导致TGF-β1异常活化[15]；突变位于第4外显子区域，即LAP的C末端错义突变(p.R218C/H、p.H222D、p.C223R/S/G、p.C225R)，破坏二硫键形成，引起LAP结构异常，环状复合物二聚体解离，TGF-β1被激活[16]。上述PDD致病突变，最终均使循环和骨骼中活性TGF-β1比例升高，引起骨细胞增生、骨转换增快，抑制正常骨骼矿化，从而出现骨转换加快，局部骨皮质增生、硬化，骨密度下降，骨折风险增加。在以上突变中，p.R218C约占所有突变60%以上，被认为是PDD的热点突变[17]，中国人群中已有该突变的报道[6, 12]，本例也是由该热点突变所致。该突变位点位于高度保守的疏水区，通过影响LAP二硫键形成, 导致TGF-β1异常活化[16]。
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| 图 4 进行性骨干发育不良症患者TGFB1基因突变类型 Figure 4 TGFB1 mutations type in progressive diaphyseal dysplasia ★：影响TGF-β1前体复合物分泌; ●：引起局部电子异常交换; ▲：破坏二硫键形成; ex：外显子; 本例患者携带第4外显子区c.652C＞T(p.R218C)突变 |
PDD尚无理想的治疗措施，目前均为对症治疗[12]。糖皮质激素能够抑制骨形成，缓解骨骼肌肉疼痛，已有研究报道短期使用糖皮质激素能够改善患者临床症状[12, 18]，但合适的治疗剂量、疗效观察指标尚不清楚，长期药物治疗对儿童生长及骨骼的影响值得关注[5]。有研究显示双膦酸盐能够抑制PDD患者骨吸收，增加骨密度，降低骨折风险，缓解病情[19-20]，但也有研究显示双膦酸盐会加重PDD患者骨痛[21]。降钙素和非甾体抗炎药主要用于缓解疼痛[5]。近期，新西兰研究发现血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂具有抑制TGF-β1信号通路作用，能够缓解PDD患者疼痛，提高活动能力[22]。动物实验发现TGF-βⅠ型受体拮抗剂能够改善PDD骨骼损害[23]。未来针对骨骼和肌肉局部TGF-β1及其下游分子的靶向治疗，可能成为PDD的有效治疗措施[24]。
综上所述，PDD是一种罕见常染色体显性遗传性骨病，对本例PDD患者的临床表型及致病机制研究，表明TGFB1基因激活性突变可导致PDD，p.R218C突变是该病的热点突变，其导致患儿骨骼异常及肌肉减少。本研究对PDD表型及致病分子机制的研究，有助于加深对此罕见遗传性骨病的认识。
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| (收稿日期：2017-09-18) |