DOI: 10.3969/j.issn.1674-2591.2018.02.011
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引用本文

杨芳芳, 葸慧荣, 高玉海, 李文苑, 马慧萍, 陈克明. 丹参酮ⅡA对去卵巢大鼠骨密度及骨形态计量学的影响[J]. 中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志, 2018, 11(2): 166-171
YANG Fang-fang, XI Hui-rong, GAO Yu-hai, LI Wen-yuan, MA Hui-ping, CHEN Ke-ming. Effect of tanshinone ⅡA on bone mineral density and bone histomorphometry in ovariectomized rat[J]. Chinese Journal of Osteoporosis and Bone Mineral Research, 2018, 11(2): 166-171

工作空间

丹参酮ⅡA对去卵巢大鼠骨密度及骨形态计量学的影响
杨芳芳1, 葸慧荣1, 高玉海1, 李文苑1, 马慧萍2, 陈克明1     
1. 730050 兰州，兰州总医院骨科研究所;
2. 730050 兰州，兰州总医院药剂科
基金项目：国家自然科学基金（81471090）
通讯作者：陈克明, E-mail:chenkm@lut.cn
摘要：目的 研究丹参酮ⅡA对去卵巢大鼠骨密度（bone mineral density，BMD）和骨形态计量学的影响，探讨丹参酮ⅡA对雌激素缺乏引起的骨质疏松症（osteoporosis，OP）的治疗作用。方法 3月龄SD雌性大鼠40只，采用数字表法随机分为假手术组（Sham）、单纯卵巢切除组（Ovx）、雌激素治疗组和丹参酮ⅡA治疗组，每组10只。手术后1周，雌激素组给予炔雌醇200 μg/kg；丹参酮ⅡA治疗组给予丹参酮ⅡA 11 mg/kg；Ovx组与Sham组每日给予与治疗组同等体积的0.9%氯化钠注射液，给药方式均为口服，1次/d。每2周称1次体质量，每个月检测全身BMD，3个月后处死所有实验动物并取材。测定椎骨和右侧股骨的离体BMD和生物力学性能；品红-苦味酸染色（Van-Gieson，VG）进行骨形态分析；大鼠处死前按时间依次皮下注射四环素、茜素红和钙黄绿素，镜下观察各组3种荧光之间的距离变化；计算子宫系数，并在光镜显微镜下观察子宫病理切片中各组子宫内膜厚度的变化。结果 Ovx组大鼠体质量（282.38±16.92）明显增加，给予丹参酮ⅡA治疗的大鼠体质量增长与Sham组差异无统计学意义（P > 0.05），雌激素组大鼠体质量（248.33±15.57）明显低于其他各组，差异有统计学意义（P < 0.01）；丹参酮ⅡA组大鼠的子宫系数（0.925±0.553）与Ovx组（0.900±0.389）比较略高，差异无统计学意义（P > 0.05），但明显低于雌激素组（2.386±0.495），差异有统计学意义（P < 0.01）；与Ovx组相比，丹参酮ⅡA组的全身BMD（0.149±0.008）、股骨三点弯曲试验和椎骨压缩试验的最大载荷（159.86±12.37、267.58±33.4）均有所提高，差异有统计学意义（P < 0.05），而丹参酮ⅡA组和雌激素组组间差异无统计学意义（P > 0.05）；丹参酮ⅡA组的弹性模量与Ovx组之间差异无统计学意义（P > 0.05），但丹参酮ⅡA组均值高于Ovx组；骨形态计量分析结果显示丹参酮ⅡA组和雌激素组较Ovx组骨小梁明显变多变密，改善了松质骨的微结构；荧光标记观察表明口服丹参酮ⅡA和炔雌醇可加快骨的生长；子宫病理切片观察到Ovx组子宫内膜组织萎缩变薄，丹参酮ⅡA组与假手术组相差不大，雌激素组子宫内膜明显增厚，与子宫系数呈现相同的趋势。结论 丹参酮ⅡA可通过增加BMD，提高骨质量，改善骨微结构预防与治疗雌激素缺乏引起的OP，而刺激子宫组织增生的不良反应又远比雌激素小，对探索抗OP中药单体新药有非常重要的意义。
关键词：骨质疏松症     丹参酮ⅡA     去卵巢大鼠     骨密度     骨形态计量学    
Effect of tanshinone ⅡA on bone mineral density and bone histomorphometry in ovariectomized rat
YANG Fang-fang1, XI Hui-rong1, GAO Yu-hai1, LI Wen-yuan1, MA Hui-ping2, CHEN Ke-ming1     
1. Department of Orthopedics, Lanzhou General Hospital, Lanzhou 730050, China;
2. Department of Pharmacy, Lanzhou General Hospital, Lanzhou 730050, China
Abstract: Objective To study effects of tanshinoneⅡA on bone mineral density and bone histomorphometry in ovariectomized rat, and to explore the therapeutic effect of tanshinone ⅡA on osteoporosis induced by estrogen deficiency. Methods Forty female SD rats only 3 months old, randomly divided into control group (Sham), ovariotomized group (Ovx), estrogen therapy group and tanshinone ⅡA treatment group, 10 in each group. 1 week after the operation, estrogen group were administered as estrogen, 200 μg/kg; Tanshinone ⅡA treatment group were given tanshinone ⅡA, 11 mg/kg; The Ovx group and sham group were given the same volume of saline to the treatment group daily, orally once. Rats were weighed once every 2 weeks, whole body bone density was detected monthly, All experiment animals were executed after 3 months and got a sample. The bone density and biomechanical properties of the vertebrae and the right femur were determined. The bone morphological analysis was carried out by the dyeing of magenta-bitter acid (Van-Gieson, VG). Before the rats were executed, they were injected tetracycline, alizarin red and calculitin subcutaneously, and observed the changes of distance between the three fluorescence of each group under the microscope. The uterine coefficient was calculated and the changes of endometrial thickness were observed under the microscope. Results The body quality of Ovx group(282.38±16.92) was obviously increased, there was no significant difference between the tanshinone ⅡA group and sham group; estrogen group(248.33±15.57) was obviously lower than other groups, and has a very significant difference (P < 0.01). The rat uterus coefficient(0.925±0.553) of tanshinone ⅡA group is slightly higher than that of Ovx group(0.900±0.389), but without significant difference (P > 0.05), which was significantly lower than the estrogen group(2.386±0.495), the difference was statistically significant (P < 0.01);Compared with the Ovx group, whole body BMD (0.149±0.008), the maximum load of three point bending test and compression test of vertebrae (159.86±12.37, 267.58±33.40) of tanshinone ⅡA group were improved, the difference was significantly (P < 0.05), while there was no significant difference between tanshinone ⅡA group and estrogen group; the modulus of elasticity has no significant difference between tanshinone ⅡA group and Ovx group (P > 0.05), but the average of tanshinone ⅡA group is higher than that of Ovx group; Bone morphometric analysis showed that the bone trabeculas of tanshinone ⅡA group and estrogen group were more variable density than that of Ovx group, suggested that tanshinone ⅡA could improve bone microstructure; Fluorescent tags observation showed that oral tanshinone ⅡA and ethinylestradiol could accelerate the growth of bone; Endometrial tissue atrophy and thinning were observed in Ovx group, the difference between tanshinone ⅡA group and sham group was not significant, and endometrium thickening was observed in estrogen group, and those trend was the same as that in uterine coefficient. Conclusion Tanshinone ⅡA could prevent and treat the osteoporosis caused by lack of estrogen by increasing bone mineral density, bone quality and improve bone microstructure, however, the adverse reaction of stimulating uterine hyperplasia is much smaller than that of estrogen, which is of great significance in exploring new anti-osteoporosis traditional Chinese medicine monomer.
Key words: osteoporosis     tanshinone ⅡA     ovariectomized rat     bone mineral density     bone histomorphometry    

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种以骨量减少、骨的微观结构退化为特征，并表现为骨脆性增加及易于发生骨折的全身性骨骼疾病[1]。OP易发生于绝经后妇女[2-3]。蔡辉等[4]认为活血化瘀中药在治疗OP上呈现出多靶点、多环节、多通路, 效果明显, 不良反应少等特点。因此探索活血中药预防与治疗骨质疏松症无疑具有潜在价值。丹参酮ⅡA是活血化瘀中药丹参中主要有效成分之一。实验研究表明丹参酮具有较温和的雌激素样活性[5]，丹参酮ⅡA对体外培养破骨细胞具有抑制作用[6-7]，并能抑制骨吸收及降低骨转换率以延缓或阻断绝经后快速骨丢失[8]，能防止去卵巢大鼠腰椎和胫骨松质骨的丢失[9]。本实验以卵巢摘除大鼠为骨质疏松模型，观察丹参酮ⅡA对雌激素缺乏引起OP的防治作用。

材料与方法 试剂与仪器

丹参酮ⅡA(陕西宝鸡辰光生物科技有限公司，批号：20150816)；炔雌醇(湖北康宝泰精细化工有限公司，批号：20160801)；10%水合氯醛(天津市光复精细化工研究所)；双能X线骨密度仪(Lunar Prodigy, GE公司，美国)；AG－IS万能材料试验机(岛津公司，日本)；SP1600硬组织切片机(LEICA公司，德国)；正置荧光显微镜(BX51，Olympus公司，日本)。

实验动物

3月龄SD雌性大鼠40只，体质量(240±3)g，购买于中国农业科学院兰州兽医研究所，实验动物合格证号：SCXK(甘)2015-0001，饲养于兰州军区总医院动物科SPF级实验室，实验室许可证号：SYXK(军)2012-0029，自由饮水(自来水)和进食。

分组和给药

3月龄SD大鼠采用数字表法随机分为4组，每组10只，分别为假手术组(Sham组)、单纯卵巢切除组(Ovx组)、雌激素治疗组和丹参酮ⅡA治疗组。1周后每组口服给药，丹参酮ⅡA用蒸馏水配成1.1 g/L的混悬液，按每只大鼠11 mg/(kg·d)给药；雌激素组用蒸馏水将炔雌醇配成0.02 g/L的溶液，按每只大鼠200 mg/(g·d)给药；单纯卵巢摘除组与假手术组每日给予与治疗组同等体积的蒸馏水，每两周称1次体质量。根据成魁等[10]用金雀异黄酮的浓度(10 mg/kg)转换成同样摩尔浓度的蛇床子素(与前者为不同物质)的方法换算出丹参酮ⅡA的给药剂量，即为11 mg/kg。

骨密度的测定

1个月测1次全身骨密度(bone mineral density，BMD)，检测前先腹腔注射10%水合氯醛(0.3mL/kg)麻醉，给药3个月后处死所有实验动物，剥离椎骨、双侧股骨和胫骨，并保存于4%多聚甲醛中，测定椎骨和左侧股骨BMD。

大鼠股骨三点弯曲实验

将右侧股骨从4%多聚甲醛中取出，剔除附着的组织，进行三点弯曲试验。跨距为13 mm，速度为10 mm/min。记录载荷变形曲线，得到最大载荷和弹性模量等指标。

大鼠椎骨压缩实验

将椎骨从4%多聚甲醛中取出，剪取大鼠L4椎，除去附着的组织，将椎体上下两面磨平，置于钢制平台上，进行压缩实验，加载速度为2 mm/min，过最大载荷后停止加载，记录载荷变形曲线，得出最大载荷和弹性模量等指标。

骨形态计量分析

将右侧胫骨从4%多聚甲醛中取出。依次进行脱水、包埋、切片，再用1 000、1 500、2 000目的砂纸均匀打磨至半透明，用品红-苦味酸Van-Gieson, VG)进行染色。镜下观察骨组织形态结构。

荧光标记

大鼠处死前第21、22天皮下注射四环素，剂量为25 mg/kg；处死前第13、14天皮下注射茜素红，剂量为30 mg/kg；处死前第3、4天皮下注射钙黄绿素，剂量为10 mg/kg。按前述方法制成不脱钙切片(未染色的白片)，镜下观察各组3种荧光之间的距离变化，并用IPP6.0软件进行量化。

子宫内膜形态学观察

处死大鼠后，称取子宫质量，计算子宫系数(子宫系数=子宫质量/大鼠体质量)。将其固定于10%甲醛中，经过固定、脱水、包埋、切片、HE染色和封片等处理后，在光镜显微镜下进行观察各组子宫内膜厚度的变化。

统计学方法

采用SPSS 17.0分析软件进行分析，数据用平均值±标准差(x±s)表示，单因素方差分析采用LSD法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果 各组大鼠体质量改变和子宫系数观测值

Ovx组大鼠体质量明显增加，给予丹参酮ⅡA治疗大鼠体质量增长与假手术组差异无统计学意义，雌激素组大鼠体质量增加落后于其他各组，差异有统计学意义(P＜0.01)。丹参酮ⅡA组的子宫系数比Ovx组高，但差异无统计学意义(P＞0.05)，而明显低于雌激素组，且差异有统计学意义(P＜0.01)(表 1)。

表 1 大鼠体质量和子宫系数观测值(x±s) Table 1 Comparison of body weight and uterus coefficient of rats among different intervention groups(x±s)
组别 体质量(kg) 子宫系数
(g/kg)
实验前 实验后
基线组 240.10±9.97 - -
Ovx组 240.20±13.34 282.38±16.92 0.900±0.389
Sham组 240.00±9.98 259.75±18.12* 3.000±1.865**
丹参酮ⅡA组 242.10±11.28 278.2±11.65 0.925±0.553
雌激素组 243.20±11.26 248.33±15.57** 2.386±0.495**
OVX:卵巢切除；Sham:假手术；与Ovx组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
表选项
大鼠BMD测定结果

3个月后，Ovx组与Sham组相比，全身BMD、离体的股骨和椎骨BMD明显下降。与Ovx组相比，丹参酮ⅡA组和雌激素组的全身BMD明显提高，差异有统计学意义(P＜0.05)，而丹参酮ⅡA组和雌激素组组间比较，差异无统计学意义(P＞0.05)(表 2，3)。

表 2 不同干预组大鼠全身BMD比较(x±s) Table 2 Comparison of whole body bone mineral density among rats of different intervention groups(x±s)
组别 全身BMD(g/cm2)
1个月后 2个月后 3个月后
Ovx组 0.143±0.006 0.143±0.004 0.143±0.005
Sham组 0.141±0.008 0.146±0.006 0.153±0.005*
丹参酮ⅡA组 0.144±0.007 0.148±0.009 0.149±0.008*
雌激素组 0.147±0.005 0.147±0.009 0.153±0.008*
Ovx:卵巢切除；Sham:假手术；BMD:骨密度；与Ovx组比较，*P＜0.05
表选项
表 3 不同干预组大鼠股骨和椎骨BMD比较(x±s) Table 3 Comparison of femoral and vertebral bone mineral density among different intervention group(x±s)
组别 股骨BMD(g/cm2) 椎骨BMD(g/cm2)
Ovx组 0.1343±0.0082 0.1346±0.0096
Sham组 0.1433±0.0035* 0.1461±0.0078**
丹参酮ⅡA组 0.1426±0.0075* 0.1440±0.0055*
雌激素组 0.1421±0.0092* 0.1446±0.0098**
Ovx:卵巢切除；Sham:假手术；BMD:骨密度；与Ovx组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
表选项
大鼠骨生物力学实验结果

Ovx组与Sham组相比，股骨三点弯曲实验和椎骨压缩实验的最大载荷均明显下降, 差异有统计学意义(P＜0.05)，虽然弹性模量的差异无统计学意义(P＞0.05)，但也有下降趋势。与Ovx组比较:丹参酮ⅡA组和雌激素组股骨三点弯曲实验和椎骨压缩实验的最大载荷均有所提高，差异有统计学意义(P＜0.05)，而丹参酮ⅡA组和雌激素组组间差异无统计学意义(P＞0.05)；丹参酮ⅡA组弹性模量与Ovx组之间差异无统计学意义(P＞0.05)，但丹参酮ⅡA组的均值高于Ovx组(表 4，5)。

表 4 不同干预组大鼠股骨三点弯曲实验参数比较(x±s) Table 4 Comparison of parameters of femoral three point bending test among different intervention groups(x±s)
组别 最大载荷(N) 弹性模量(mPa)
Ovx组 140.74±13.29 8 036.5±2 756.2
Sham组 161.82±23.61* 8 747.2±3 407.9
丹参酮ⅡA组 159.86±12.37* 10 043.9±2 766.5
雌激素组 161.96±15.75* 11 115.6±3 208.1*
Ovx:卵巢切除；Sham:假手术；BMD:骨密度；与Ovx组比较，*P＜0.05
表选项
表 5 不同干预组大鼠椎骨压缩实验参数比较(x±s) Table 5 Comparison of vertebral compression test parameters of different intervention groups(x±s)
组别 最大载荷(N) 弹性模量(mPa)
Ovx组 214.13±70.30 284.92±110.94
Sham组 282.77±34.79* 416.68±170.71
丹参酮ⅡA组 267.58±33.42* 292.44±128.34
雌激素组 271.03±30.99* 292.39±112.29
Ovx:卵巢切除；Sham:假手术；BMD:骨密度；与Ovx组比较，*P＜0.05
表选项
骨形态计量分析结果

骨组织呈红色，骨骺线下红色网状结构为骨小梁，Ovx组红色结构稀疏，丹参酮ⅡA组和雌激素组骨小梁结构与假手术Sham组相差不大，并明显密于Ovx组(图 1)。

图 1 不同干预组大鼠胫骨近心干骺端骨组织形态学比较(×40) Figure 1 Morphological comparison of proximal tibial metaphysis among different intervention groups (×40)
图选项
荧光标记观察结果

与Ovx组相比，丹参酮ⅡA组和雌激素组的大鼠胫骨钙黄绿素和茜素红之间、茜素红和四环素之间的距离明显较大, 表明口服丹参酮ⅡA可加快骨的生长(图 2)。给药组均与Ovx组有极显著差异，与Sham组的值相差不大(表 6)。

图 2 不同干预组胫骨中段皮质骨荧光标记结果比较(×20) Figure 2 Comparison of fluorescence labeling of cortical bone in the middle tibia among different intervention groups (×20) 黄色为四环素标记，红色为茜素标记，绿色为钙黄绿素标记
图选项
表 6 不同干预组大鼠荧光标记量化值比较(x±s) Table 6 Comparison of fluorescent marker quantifi-cation value among different intervention groups(x±s)
组别 荧光距离(μm)
L(黄-红) L(红-绿)
Ovx组 15.77±0.99 10.09±1.23
Sham组 22.70±1.16** 16.08±1.09**
丹参酮ⅡA组 22.55±1.58** 16.78±1.24**
雌激素组 24.10±0.85** 16.80±0.56**
Ovx:卵巢切除；Sham:假手术；与Ovx组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
表选项
子宫病理切片观察结果

Sham组子宫内膜较厚，腺体较多，表面为一层高而密的假柱状上皮；Ovx组子宫内膜组织萎缩变薄，腺体稀少，表面为一层小而圆的单层上皮细胞；丹参酮ⅡA组与Sham组相差不大，雌激素组子宫内膜明显增厚(图 3)。

图 3 不同干预组大鼠子宫组织形态学比较(×40) Figure 3 Morphology of uterine tissue under the optical microscope(×40)
图选项
讨论

妇女绝经或经卵巢摘除术后，由于体内雌激素水平的降低而使骨代谢呈负平衡，破骨细胞性骨吸收增强，成骨细胞性骨形成减少，骨量逐步减少。雌激素对绝经后OP的疗效已经得到充分的肯定，但其诸多的不良反应使人们不得不继续寻找有效药物。中草药治疗绝经后OP已成为国内医学界的研究热点。

骨骼强健与否有赖后天气血之充养，气血对骨骼的滋养是骨骼维持正常形态和功能的关键，而一旦瘀血阻滞，脉络不通，骨失所养，必发为“骨痿”。目前，中医临床上偏重于补肾，而忽略了活血化瘀药的作用。早期就有研究发现丹参酮可以防止以维甲酸诱导的大鼠OP模型的骨丢失，其机制可能与提高激素水平、抑制骨高转换有关[11]。因此考虑丹参酮ⅡA是否具有预防与治疗由雌激素缺乏引起的OP。目前国内外还未发现关于丹参酮ⅡA治疗以切除卵巢大鼠所致的绝经后OP症模型的相关研究。本实验以卵巢摘除大鼠为骨质疏松模型，观察丹参酮ⅡA对雌激素缺乏引起OP的防治作用。

BMD和骨生物力学是检测骨质量的两个重要的部分，其中BMD为黄金指标[12]。骨形态计量学是对骨组织微结构的一个重要的评价指标，反映了机体组织形态学方面的变化。本实验应用丹参酮ⅡA治疗的大鼠其BMD与卵巢切除组差异有统计学意义，而与假手术组的差异无统计学意义，充分肯定了丹参酮ⅡA在防治大鼠卵巢摘除后骨质疏松中的作用。从实验中切下的子宫标本看，炔雌醇组大鼠子宫明显增大增粗，而丹参酮ⅡA组与假手术组相近，卵巢切除组则明显萎缩，在子宫系数的对比中可以看到这一明显趋势。研究各项指标显示炔雌醇的防治作用优于丹参酮ⅡA，但是其对子宫的不良反应大。

综上所述，3个月后，单纯摘除卵巢组与假手术组相比，全身BMD、骨质量明显下降，而丹参酮ⅡA和雌激素明显提高了大鼠BMD和骨质量，并改善了骨的微观结构、加快了骨的生长。表明丹参酮ⅡA和炔雌醇对去卵巢大鼠所致的骨丢失起到防治作用。但丹参酮ⅡA在体内的代谢尚不清楚，进一步探索丹参酮ⅡA对绝经后OP的研究很有必要，可为更具选择性与安全性的绝经后OP治疗新药的开发提供理论依据与实验基础。

参考文献
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(收稿日期：2017-09-30)