颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy, TLE）患者常有意识障碍、广泛的神经认知功能障碍和生活质量下降，是临床环境中最常见的部分复杂癫痫发作类型^[1-3]。20%~30%的颞叶癫痫患者使用抗癫痫药物效果不佳^[4]；同时，颞叶癫痫也是最常见的难治性局灶性癫痫，在癫痫患者中发生率为40%^[5]，其发病机制一直是癫痫研究的热点。颞叶癫痫存在神经发生和血管生成，其病理表现主要为海马齿状回（DG）、CA1及CA3区的神经元丢失、代偿的胶质增生、新生颗粒细胞的形成及突触的重建和异常神经环路的形成^[6]。癫痫后海马DG新生神经元可出现树突的延长并伸入至CA3区内分子层与锥体细胞树突形成新的突触联系，从而形成新的异常的神经环路，成为自发性痫性发作的爆发点^[6]。

研究表明，在脊椎动物中枢神经系统的正常发育中，Eph受体及其配体ephrins发挥着轴突导向的重要作用，并在海马内有着广泛的表达^[6]，它们是受体酪氨酸激酶的最大成员，通过细胞间接触的相互作用参与细胞增殖、分化、迁移和组织重塑^[7-9]。EphA5及其配体ephrinA5相互作用引起N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）和突触后密度蛋白95（PSD-95）的协同表达，可能诱导α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor, AMPAR）及其相互作用蛋白表达以及向突触调节过渡的发育转换，可以在海马早期发育过程中触发突触形成^[10-11]。TLE小鼠模型在持续癫痫发作后的第3天，将ephrinA5-Fc注入海马，连续处理7 d后，小鼠的自发性、复发性癫痫发作频率和强度均减弱，双皮质素阳性的神经元祖细胞在颗粒下区域减少，而微血管的密度在门静脉减少，这些均表明体外注射ephrinA5-Fc融合蛋白可有效抑制癫痫的发作^[12]。Liu等^[13]应用氯化锂-匹罗卡品颞叶癫痫大鼠模型发现配体ephrinA5协同受体EphA5在海马CA3区的表达下调，认为ephrinA5与EphA5可能共同参与了CA3区的苔藓纤维出芽作用机制，并与癫痫的发生、发展关系密切。

治疗癫痫的方法目前主要包括药理学和非药理学方法，其中药理学中许多抗癫痫药物的作用源于γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid, GABA）介导的抑制作用增强，γ-氨基丁酸是成人中枢神经系统的主要抑制性神经递质，γ-氨基丁酸受体功能的改变与颞叶癫痫有关^[14]。然而，研究发现将近20%~40%的癫痫患者可能患有耐药性癫痫（drug resistant epilepsy, DRE）。在这些患者中，抗癫痫药物不能有效地控制癫痫发作^[15]。近些年来，非药理学方法在治疗癫痫中越来越受到关注。非药理学方法主要有饮食疗法和神经调节疗法^[15]。其中，神经调节技术包括迷走神经刺激、脑深部刺激和经颅磁刺激^[15]。研究表明，耳针电针可以有效降低晚期创伤性癫痫的发生^[16]；低频率的电针刺激风池穴对改善癫痫和癫痫引起的睡眠障碍有好处^[17]；针刺足三里（St36）、大椎（Du14）、百会（Du20）等特定穴位，能够有效治疗癫痫^[18-19]。尽管非药理学在癫痫的临床治疗方面有明确的疗效，但其内在机制却缺乏深入的研究，鉴于非药理学及癫痫发作和治疗机制的研究结果，电针的抗癫痫作用和抗癫痫机制是否与已知的ephrinA5调控机制有关，目前尚未有报道。

本研究将大鼠致癫痫后的海马CA3及DG区作为主要的研究区域，应用与人颞叶癫痫临床及病理特征相似的氯化锂－匹罗卡品颞叶大鼠作为模型，通过行电针百会和大椎穴治疗处理，测定ephrinA5 mRNA及蛋白在海马CA3及DG区表达的变化特点，分析电针百会和大椎穴对ephrinA5在颞叶癫痫中表达的影响，进而探讨针灸对癫痫治疗的内在机制。

1 材料与方法 1.1 实验动物

30只SD雄性大鼠均来自北京维通利华动物实验中心，体质量220~250 g，温度（22±3）℃、12 h明暗循环的饲养环境中，给予自由饮食和饮水。适应性喂养1周后随机选取10只作为对照组，20只用于癫痫造模。取10只造模成功后的大鼠用于电针治疗。所有实验内容经苏州高新区人民医院动物伦理委员会同意。

1.2 仪器和试剂

戊巴比妥钠（1507002-200MG）；脑立体定位仪（51600，美国stoelting）；G6805-2电针治疗仪（中国青岛鑫升实业有限公司）；LiCl（美国Boehringer Mannheim公司）；PILO（美国Sigma公司）；ephrinA5抗体（ab70114, Abcam）。

1.3 大鼠癫痫模型的制备

大鼠腹腔注射3 mEq/kg（约125 mg/kg）的LiCl；18 h后腹腔注射PILO，每次10 mg/kg，每30 min 1次，直至大鼠出现癫痫持续状态（SE）30 min，则可用10%水合氯醛终止发作。发作程度按Racine制定的标准进行分级。

1.4 电针治疗

大鼠吸入乙醚进行麻醉，然后将大鼠头部固定于脑立体定位仪上。选用1寸毫针平刺百会穴和斜刺大椎穴，约7 mm。用G6805-2电针治疗仪进行电针。电针采用疏密波，密波：6.25 Hz，强度：1.0 mA，时间：2.08 s；疏波：3.85 Hz，强度：1.0 mA，时间：1.28 s；持续30 min。

1.5 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测检测ephrinA5 mRNA水平表达

检测大鼠脑组织ephrinA5 mRNA表达。将脑组织于冰上匀浆，提取脑膜组织中总RNA，利用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，应用Primer 5.0软件设计ephrinA5和GAPDH mRNA的特异性引物，GAPDH作为内参照。引物序列分别为：大鼠GAPDH正向5'-ACTCCCATTCT-TCCACCTTTG-3'；反向5'-CCCTGTTGCTGTAGCCATATT-3'；ephrinA5正向5'-AGTCGTCGCCGACCGCTACGCCGT-3'；反向5'-TCTGGGACAGAGTCCTCATAGTGA-3'；每个样本做3个复孔检测，PCR反应体系总体积为20 μL，反应条件：42℃孵育2 min；95℃预变性30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40个循环；用ABI7500系统软件进行数据采集、分析。利用qRT-PCR测定对照基因和目的基因的Ct值，将Ct值转化为相对倍数。从而计算目的基因的表达量：采用实验组/对照组=2^-ΔΔCt进行计算；其中Ct=（Ct目的-Ct参照）实验-（Ct目的-Ct参照）对照。

1.6 Western blotting检测ephrinA5蛋白表达

取大鼠脑组织，液氮磨成粉末，加入100 μL PBS，50 μL收集的蛋白中，加入150 μL 4×loading buffer，混匀后，100度水浴5 min，冰上冷却。

配置好分离胶和浓缩胶，每孔上样40 μL，电泳90 min。转移结束后关掉电源，取出PVDF膜放入容器（培养皿）中，加适量的封闭缓冲液（含5%（w/v）脱脂奶粉的PBS缓冲液），室温轻轻摇动温育1~2 h。换新的培养皿，加入10 ml上述封闭缓冲液，并按1：1000的量加入兔抗大鼠ephrinA5多克隆抗体（一抗），4℃孵育过夜。PBS缓冲液洗涤3次，每次10 min。将PVDF膜转移至另一培养皿中，加入含有5%脱脂奶粉的二抗缓冲液，并以1∶5000量加入HRP标记羊抗兔IgG（二抗），室温摇动温育1 h。再将PVDF膜转移至另一培养皿中，加适量二抗缓冲液（150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-Cl pH 7.5），室温洗涤3次，每次10 min。ECL加底物显色液，拍照。

1.7 免疫组织化学检测ephrinA5蛋白表达

3组大鼠进行灌注取材，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，迅速取出脑组织，4℃ 4%多聚甲醛固定12 h。取出脑组织后常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，在石蜡中浸泡并进行包埋。以切片厚度4 μm进行连续冠状切片。石蜡切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精至水；加入含1%Triton和3% H₂O₂的PBS溶液，于4℃冰箱中孵育30 min，以去除内源性过氧化物酶，PBS漂洗3次，每次5 min；滴加含有10%BSA的封闭液封闭约2 h；加入1∶100稀释的兔抗大鼠ephrinA5多克隆抗体（一抗），于4℃冰箱中孵育过夜，PBS漂洗3次，每次5 min；然后滴加生物素标记羊抗兔IgG（二抗）工作液，室温下孵育约1 h，PBS漂洗3次，每次5 min；DAB显色液显色，显微镜下观察显色情况并予PBS终止显色反应。

1.8 统计学方法

采用SPSS 21.0统计软件包对数据进行统计学分析。计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 癫痫大鼠电针治疗后海马组织ephrinA5 mRNA表达变化

qRT-PCR结果显示：与对照组比较，ephrinA5 mRNA在癫痫组大鼠海马组织中的表达下调，差异有统计学意义（P < 0.05）；连续8周电针百会和大椎穴治疗后，大鼠海马组织中ephrinA5 mRNA表达水平与癫痫组相比有上调，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表 1。

2.2 癫痫大鼠电针治疗后海马CA3和DG区ephrinA5蛋白水平表达变化

Western blotting结果显示，与对照组比较，癫痫组大鼠海马组织中ephrinA5蛋白表达有下调；连续8周电针百会和大椎穴治疗后，与癫痫组相比，大鼠海马组织中ephrinA5蛋白表达水平上调（图 2）。这个结果和qRT-PCR结果相一致。

免疫组化实验结果显示，ephrinA5在对照组大鼠海马CA3和DG区锥体细胞层均有广泛表达（图 3A和图 3D）。与对照组比较，ephrinA5蛋白在癫痫组大鼠海马CA3区的表达也减少（图 3E）；与癫痫组相比，癫痫+电针组大鼠海马CA3区ephrin A5的表达增加（图 3F）。在DG区，癫痫组和电针+癫痫组中ephrinA5蛋白水平与对照组相比变化不明显（图 3A、图 3B和图 3C）。因此，ephrinA5蛋白在癫痫组和癫痫+电针组中大鼠海马组织CA3区的表达结果与ephrinA5 mRNA的表达变化相一致。

3 讨论

颞叶癫痫是一种临床上常见的复杂癫痫类型，其发病机制是癫痫研究中的重点。通过氯化锂－匹罗卡品颞叶癫痫大鼠模型与人类颞叶癫痫相似^[20]，是研究颞叶癫痫发生机制的重要途径。研究表明，颞叶癫痫病理主要表现为海马DG、CA1及CA3区的神经元丢失、代偿的胶质增生、新生颗粒细胞的形成及突触的重建和异常神经环路的形成^[6]。癫痫发生时，海马DG新生神经元出现树突的延长，并伸入至CA3区内分子层与锥体细胞树突形成新的突触联系，从而形成自发性^[6]。海马CA3和DG区是颞叶癫痫的重要参与者^[21]。最近的研究表明，脑中ephrinA5及其受体EphA5有很高的表达^[22]，而氯化锂－匹罗卡品致痫后，ephrinA5 mRNA在CA3区的表达明显下调^[13]。本研究中RT-PCR和Western blotting结果也证实了ephrinA5 mRNA和蛋白表达水平在癫痫组大鼠海马组织中均下调。鉴于Eph受体及其配体ephrins在调节神经元突触结构及其生理特性中的关键作用^[23-26]，而且ephrinA5在海马发育的突触连接和重建上发挥着重要作用^[27]，可以说明ephrinA5在海马区表达量下调和功能缺失对颞叶癫痫发作至关重要。

作为一种代表性的非药理学治疗方法，电针目前已经应用于癫痫患者临床治疗。Dos等^[28]研究表明，电针足三里穴可防止一些边缘结构的萎缩，并且能够改善毛果芸香碱引起的癫痫模型大鼠的认知缺陷。电针治疗后，一氧化氮合酶的减少^[29]和褪黑素的增加^[30]，有助于抗癫痫作用。研究还发现电针能提高癫痫大鼠中枢神经系统γ-氨基丁酸水平，说明电针抗癫痫作用可能部分归因于其调节中枢神经系统γ-氨基丁酸水平的作用^[31]。然而，电针治疗癫痫是否还存在其他可能的原因尚待进一步的研究，其中深入分析电针与癫痫发生密切相关的ephrinA5基因表达尤为重要。本研究结果表明，在氯化锂－匹罗卡品诱导的癫痫大鼠中，电针百会和大椎穴可以有效提高ephrinA5的mRNA和蛋白表达水平，从而起到一定的抗癫痫作用。在TLE小鼠模型中，体外注射ephrinA5-Fc至海马区，小鼠的自发性复发癫痫发作频率和强度在接下来的2周中明显减弱^[10]。结合本研究结果，说明电针治疗癫痫的机制可能与其促使大鼠海马中ephrinA5表达的升高直接相关。免疫组化结果显示，持续的电针治疗可以提高ephrinA5在海马CA3区中的表达；而DG区无论是癫痫组还是癫痫+电针组，变化均不明显。

这些结果说明虽然海马CA3和DG区都是是颞叶癫痫的重要参与者，但颞叶癫痫发生与海马CA3区中ephrinA5表达失控关系更为密切，海马CA3区中ephrinA5的表达对电针刺激也更为敏感。这为电针治疗癫痫提供了数据支持，同时，也为电针的抗癫痫作用和抗癫痫机制研究提供了一定的理论证据。