胶质母细胞瘤(Glioblastoma，GBM)是最常见的原发恶性脑肿瘤，占所有原发性脑和中枢神经系统(central nervous system，CNS)肿瘤的16%，目前还没有有效的治愈方法。手术切除是首选治疗手段，但完整切除很困难，GBM的高度浸润性可致后期疾病进展或复发。血脑屏障的存在限制大多数化疗药物在肿瘤部位积聚并增加全身毒性的风险。尽管最大限度的手术切除和放化疗联合治疗，GBM患者的生存期仍旧很短暂，迫切需要开发新的有效治疗方法。有研究发现，用嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T-cell，CART)进行靶向免疫治疗，如CD19靶向CART可在血液病中诱导持久的抗肿瘤免疫反应^[1]。受血液肿瘤的启发，人们将CART技术使用到GBM治疗中。

1 CART治疗原理

肿瘤抗原激活宿主抗肿瘤免疫的级联反应，被抗原提呈细胞摄取消化成免疫原性肽呈现于细胞表面，激活T细胞并释放细胞毒分子，作用于肿瘤。肿瘤通过募集白细胞并分泌免疫抑制性细胞因子，抑制免疫细胞的浸润功能，肿瘤细胞抗原提呈的下调及抗原的丢失使其能够逃避免疫检测。

嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)是一种人工合成的抗原受体，将抗体的特性与T细胞受体(T cell receptor, TCR)在抗原结合时发出的信号相结合，以更高的特异性重定其对特定肿瘤抗原的细胞毒作用，直接识别肿瘤细胞表面抗原，而不受HLA亚型的限制。CAR包括细胞外域和细胞内域，由一个铰链连接区和跨膜结构域(trans-membrane domain，TMD)连接，细胞外域通常由肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)特异性单克隆抗体的单链可变片段组成，细胞内域来源于第一代CAR中经典TCR的CD3ζ结构域，可能含有1个(第二代)或2个(第三代)额外的共刺激结构域，最常见的是CD28、4-1BB、CD27，可增加细胞的增殖、持久性和有效性。最常用的铰链连接区是IgG1铰链，或IgG1/4的CH2CH3结构域。最常用的TMD是CD3、CD4、CD8或CD28，它能影响CAR表面的功能表达及位置。受体完成设置后，利用基因治疗病毒载体将编码CAR结构的基因转染到T细胞分离株的基因组中，产生的CART体外扩增并重新注入体内。

2 针对GBM的有效靶点

理想的CART靶点具有以下特点：①在肿瘤细胞表面的高表达，②高度同质性，③覆盖恶性表型，④正常组织上限制表达，⑤非患者特异性。因此确定TAA是CART治疗成功的关键，但根据现今的研究成果，均显示因肿瘤的高度异质性而产生抗原丢失，针对TAA治疗GBM具有挑战性。截止目前，研究发现的胶质母细胞瘤主要有效靶点见表 1。

3 治疗阻碍

要使CART能有效根治GBM，必须使其迁移到肿瘤组织并浸润增殖足够长的时间以发挥治疗作用，且只能识别和摧毁GBM免疫抑制肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)内表达抗原的细胞，这受到GBM特有的各种因素阻碍。

3.1 CNS的特有免疫解剖

淋巴细胞进入脑实质受到血脑屏障(blood brain barrier，BBB)和胶质界膜的严格调控，脑实质及其间质液被BBB、周围血流、脑脊液分隔开，因脑部缺乏传统淋巴管，必须依赖脑脊液和间质液的有限交换才能到达外周淋巴系统。缺乏通往实质的常规淋巴通路将阻碍适应性免疫系统的传入。

3.2 抗原高度异质性

抗原异质性是GBM的一个特征，除了瘤内、瘤间异质性外，还有驱动突变表达的时间异质性，从诊断到疾病进展过程中的抗原丢失和不断演变的异质性，再加上复发的额外获得性突变，产生了对针对单一抗原的免疫治疗的抗药性，这导致没有单一的抗原可以作为涵盖整个肿瘤的通用靶点。

3.3 抗原逃逸

GBM靶点是非均一表达的，容易发生抗原逃逸。肿瘤细胞通过抗原突变、下调或删除靶抗原，及抗原阴性肿瘤亚群的选择性存活来逃避免疫识别，比如GBM中靶向HER2会导致HER2缺失肿瘤细胞的出现，从而维持非靶向肿瘤相关抗原的表达^[15]。此外，GBM发现能逃逸到外周，外周免疫系统的功能损害，如KLRG1(是位于12号染色体的基因)和CD57等耗竭标志物的稳步增加，以及转移的发生和突变负担的增加，使得颅外扩散和疾病进展成为可能^[16]。

3.4 GBM的免疫抑制TME

GBM高度免疫抑制TME限制了免疫治疗的疗效，主要由浸润的免疫抑制细胞和环境因素协同作用产生特有的TME。

3.4.1 表面分子表达的变化

GBM表达非经典HLAⅠ类分子。HLA-G影响肿瘤浸润淋巴细胞的功能，HLA-E可上调自然杀伤细胞功能。GBM能下调肿瘤表面HLAⅠ类分子的表达并抑制CD8⁺T细胞的活化。

3.4.2 缺氧的肿瘤环境

缺氧和营养耗竭是GBM共有的环境因素。栅栏样细胞过度表达缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1 α，HIF-1α)来适应低氧，HIF-1α促进髓源抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)的募集，并通过营养耗竭进一步限制CTL的功能，并导致免疫抑制的TME。低氧介导的转录激活因子3(STAT3)上调也是GBM的标志性致癌改变，STAT3激活可导致抗原提呈减少，下调CD40、CD80、CD86和MHCⅡ，并诱导产生TGF-β、IL-10等免疫抑制因子，抑制STAT3可以促进T细胞扩张并抑制调节性T细胞(regulatory T cells，Tregs)募集能力。

3.4.3 免疫抑制细胞在GBM微环境中募集

Tregs特征性表达FoxP3，通过产生免疫抑制因子TGF-β和IL-10来抑制效应T细胞的活性和增殖，其浸润程度与肿瘤分级和预后相关。髓样细胞的特定子集MDSCs，是异质性的未成熟髓样细胞群体，能产生促肿瘤因子支持新生GBM生长，并刺激Tregs增殖，诱导T细胞凋亡。GBM环境中恶性肿瘤浸润性巨噬细胞，主要表现为免疫抑制(M2)表型，这也有利于肿瘤细胞的生长、存活和转移。

3.4.4 GBM相关免疫检查点异常表达

PD-L1表达于多种癌细胞膜上，肿瘤相关PD-L1与细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)上的PD-1结合，促进CTL凋亡，从而抑制抗癌免疫应答。另外，CTLA-4和PD-1在免疫激活时上调，与其配体结合可抑制效应T细胞的增殖并增加Tregs和MDSCs的募集。

唾液酸聚糖-唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素-E(sialoglycan-Siglec-E)检查轴是一种新的糖免疫检查轴，聚唾液酸参与细胞和基质的黏附，有助于GBM的迁移、侵袭和转移，唾液酸与免疫受体(如Siglecs)结合，可增强癌细胞的免疫逃避。此外，用于脑水肿标准治疗的糖皮质激素能改变恶性肿瘤细胞中的蛋白质糖基化，增加唾液酸含量，加重逃逸^[17]。

3.4.5 基因突变

IDH1和IDH2易发生突变，通过抑制Ⅰ型免疫应答基因影响TME。IDH突变的GBM细胞产生信号转导和降低STAT1的水平，并下调效应T细胞吸引趋化因子水平及浸润率^[18]，表明GBM基因突变能够改变TME的细胞组成，有助于免疫逃避。

3.4.6 代谢紊乱

GBM重新编程营养获取和新陈代谢途径，以满足生物能量和合成需求，最主要的是糖酵解通量增加，肿瘤糖酵解活性与预后不良、肿瘤浸润和T细胞活化程度低有关。吲哚胺-2，3-双加氧酶是色氨酸代谢的关键酶，其在90%的GBM中表达上调，通过代谢色氨酸以诱导T细胞无能并增加Tregs和MDSCs的募集，与高级别GBM及短生存期相关。

3.5 淋巴细胞归巢

肿瘤分泌的趋化因子诱导T细胞的优先迁移，归巢受体使激活的T细胞对趋化因子做出反应，并影响白细胞的迁移。GBM能产生过度的血管内皮生长因子和血小板衍生生长因子，可抑制趋化因子的分泌并下调内皮细胞黏附分子的表达，招募内皮细胞，促进异常血管网络形成和瘤内间质压力升高，以抵抗淋巴细胞的浸润。GBM还诱导邻近组织的结构修饰，用致密的肿瘤相关成纤维细胞形成的基质包围肿瘤，使肿瘤细胞与周围环境隔绝。

3.6 毒副反应

由于BBB的半渗透性，目前几乎所有针对GBM的CART实验都是静脉给药。由于高强度的免疫激活，细胞因子释放综合征和肿瘤溶解综合征是最常见且严重的靶向肿瘤毒性，与治疗反应和肿瘤负荷相关，神经毒性也有发生。有研究报道，GD2靶向CART在抗肿瘤的急性阶段可引起瘤周神经炎并导致脑积水^[11]，正常组织上的CAR靶抗原也是一种风险，CART细胞误识别会导致脱靶毒性，此外，长时间低水平的CART活性会间接影响局部微环境，导致正常细胞稳态失调。

4 改进策略 4.1 提高CART细胞持久性 4.1.1 第四代CART

CART与4-1BB衍生基团的共刺激可促进长寿记忆细胞的产生。第四代CART将IL-7/12/15/18等结构基因融合到T细胞中，为CART提供有利于生存而在肿瘤外沉默的细胞因子来拮抗免疫抑制，增强CART增殖和抗肿瘤能力，减少未成熟DC、肿瘤相关小胶质细胞/巨噬细胞、Tregs和MDSCs的募集和抑制作用^[19]。

4.1.2 多靶点CAR

EGFR/EGFRvⅢ双靶向CART有效抑制EGFR和EGFRvⅢ高表达肿瘤的生长，提高小鼠的存活时间^[20]。HER2/IL-13Rα2双靶向CART不仅提高了抗肿瘤活性，还抵消了抗原逃逸^[15]。三价(HER2/IL13Rα2/EphA2)CART介导强大的免疫突触与肿瘤靶标形成更极化的微管组织中心，显示可以克服患者间的差异倾向于捕获近100%的肿瘤细胞，具有更强的细胞毒性并提高治疗存活率^[21]。

4.1.3 替莫唑胺(TMZ)预处理

在TMZ被证明可以延长患者生存期后，便作为GBM的常规临床治疗手段，其副反应是淋巴毒性。研究发现，淋巴耗竭通过减少对γ链细胞因子的竞争及抑制免疫细胞的耗尽来改善转移T细胞在体内的植入和功能，可降低肿瘤负荷。因此，TMZ预处理淋巴耗竭能经典地诱导体内CART的增殖，增加持久性^[22]，环磷酰胺也有类似的作用。

4.1.4 糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase-3，GSK3)抑制剂

GSK3在CART扩张高峰时活跃可导致克隆性收缩使T细胞死亡，GSK3抑制剂可以改善CART的扩增和记忆T细胞的产生，用GSK3抑制剂处理的IL-13Rα2靶向CART表现出减少耗竭和增加效应记忆表型的功能，初次清除肿瘤后再次攻击不会出现新的病变^[23]。

4.1.5 CD4⁺CART细胞亚群

目前大多数临床试验使用CD4⁺和CD8⁺T细胞的混合物或单独使用CD8⁺T细胞，在GBM异种移植模型中，第二代IL13Rα2CAR转导到CD8⁺或CD4⁺T细胞，CD4⁺CART显示出更强的肿瘤杀伤力和持久性，因其分泌更多IFN-γ和IL-2，而CD8⁺T细胞更容易表达耗竭标志^[24]。

4.2 阻断免疫检查点

CRISPR-Cas9技术可以干扰PD-1的信号传递，并同时编辑TRAC和B2M位点来创造潜在的现成的同种异体CART细胞，接受PD-1基因敲除的CART细胞的小鼠体外细胞因子分泌水平相似，但细胞毒性增强，肿瘤负荷降低，生存期延长^[25]。除了基因编辑技术，使用单克隆抗体的免疫检查点阻断(ICB)或CART细胞分泌PD-1阻断抗体片段也很有前景^[26]。

4.3 基因编辑

CRISPR-Cas9基因编辑技术的广泛应用使人们对特定基因进行靶向性研究，利用基因敲除及基因插入方法，可以改善CART的功能，且不会损害其效应功能。

4.3.1 基因敲除

除了敲除T细胞表面的免疫检查点分子，细胞内信号分子二酰基甘油激酶(diacylglycerol kinase，DGK)能降低CART活化，从缺乏α或ζ亚型的菌株中产生间皮素特异性CART，两种异构体的敲除均能增强细胞毒作用和IFN-γ的分泌，且双基因敲除具有协同作用。与野生型CART相比，缺少1种或2种DGK亚型的CART具有抗肿瘤细胞毒性^[27]。

4.3.2 基因插入

对CAR表达的严格转录调控是有效根除肿瘤的关键，将CAR靶向TCR位点可提供更安全、更明确、更强力的T细胞。研究显示，使用CRISPR-Cas9结合提供CD19CAR供体模板破坏TCRα链基因座，同源定向修复产生的CART肿瘤控制和存活率提高，将CAR编码序列定位于TCR位点，并置于内源性调节元件的控制之下，可减少信号，避免T细胞耗尽，提高治疗效力^[28]。

4.4 建立表达归巢受体T细胞群

全身给药的有效性取决于CART向肿瘤部位的运输，CART有效定位于肿瘤部位需要肿瘤表达的趋化因子配体及其受体的结合，可以用特定的趋化因子受体转导CART来决定组织趋向性。GBM来源的CCL2/MCP-1影响T细胞对异种移植瘤部位的体内趋化作用，用CCL2受体CCRb2基因转染CART，能增强CART在多种实体肿瘤异种移植模型中的迁移和瘤内蓄积^[29]。阻断T细胞上的CXCR4可以促进淋巴细胞从血管周围间隙逃逸到CNS实质，此外，CART经过改造，可表达乙酰肝素酶，改善其降解细胞外基质的能力，增强浸润性和抗肿瘤活性。

4.5 局部给药

GBM处于免疫抑制微环境中，与体循环隔离，静脉输送受到诸多限制，局部给药的方法更为有利。临床研究证实，EGFRvⅢ靶向CART脑内注射可消退肿瘤^[30]，脑内注射IL13Rα2靶向CART，CART持续存在7 d以上，并观察到脑脊液中趋化因子的诱导量增加，外周血则无变化，发现细胞主要停留在接种部位，这表明局部作用的CART有助于提高T细胞持久性并规避肿瘤外识别毒性^[31]。

4.6 聚焦超声

一些旨在破坏血脑屏障的治疗方法正在开发，高强度聚焦超声是一种热消融技术，可以破坏血脑屏障，但也伴随着一些组织损伤。另一种聚焦超声，使用类似于诊断超声的强度，通过静脉注射将药物和细胞因子输送到脑实质，发现经聚焦超声暴露后，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和细胞毒性T细胞(CTL)增加^[32]。

5 展望

近年来，癌症免疫治疗取得了显著的进展和突破，但GBM的CART免疫疗法只取得了有限的效果，归咎于其独有的免疫抑制TME、抗原异质性和免疫逃逸特征。GBM需要更多的技术来增强T细胞免疫的治疗效果，在将临床前的想法转化为临床领域和设计临床试验时，需要更周到的手段和方式。CART细胞在癌症的临床应用还处于初级阶段，前景十分广阔，并正在得到认可。