帕金森病(Parkinson’s disease, PD)主要病理特征是黑质致密部多巴胺能神经元(dopaminergic neurons, DAn)内α-突触核蛋白(α-synuclein, α-syn)的异常累积以及黑质DAn变性^[1-2]。PD患者尸检发现，脑组织中DNA和蛋白质的高度氧化、脂质过氧化水平增高及谷胱甘肽含量的减少^[3]，并发现活性氧(reactive oxygen species, ROS)形成和线粒体功能受损与DAn凋亡有关^[4]。目前，研发具有抗氧化剂等特性的天然药物成为预防和治疗PD的重要方向^[5]。

漆黄素是一种具有多种生物活性的天然类黄酮物质。最新研究表明，漆黄素在阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈病、抑郁症等多种神经精神疾病模型中发挥了神经保护作用，这可能与漆黄素的抗氧化应激、线粒体保护、抗炎抗免疫等多靶点神经保护活性有关^[6]。然而，漆黄素在PD中的作用及其机制尚不明确。本研究拟通过行为学实验、病理及分子生物学、氧化应激指标等多方面评估漆黄素对PD模型小鼠的神经保护作用。

1 材料与方法 1.1 材料

漆黄素(3, 7, 3', 4'-四羟基黄酮，fisetin)、MPTP(1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氢吡啶)、TH抗体(Sigma，美国)；β-actin抗体(proteintech，美国)；还原型谷胱甘肽(GSH)、总超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(T-AOC)测定试剂盒(南京建成生物，中国)；甲苯胺蓝染液(Servicebio，美国)。

1.2 实验动物

雄性C57BL/6小鼠，12~13周龄，体重24~28 g，由上海南方模式生物公司提供。每笼饲养5只小鼠，自由进食和饮水，相对湿度40%~50%，室温20~25℃，12 h/12 h昼夜节律。实验操作流程严格遵循中国实验动物操作指南，已通过上海南方模式生物中心伦理委员会的批准(IACUC: 2018-0005)。

1.3 实验动物分组及造模

将小鼠随机分为3组：control组、MPTP组和漆黄素+MPTP组，每组5只，共15只。MPTP组按照30 mg/kg的剂量连续5 d腹腔注射，复制亚急性PD小鼠模型。漆黄素+MPTP组小鼠给予100 ng/kg漆黄素^[7](溶于含1%DMSO的PBS溶液配制)连续灌胃30 d，control组和MPTP组同时给予等量含1%DMSO的PBS溶液灌胃。在漆黄素给药的第26~30 d，漆黄素+MPTP组给予MPTP连续腹腔注射5 d。

1.4 行为学实验 1.4.1 旷场实验

实验开始前，将小鼠放至实验环境中适应半小时。将小鼠放置于实验箱(40 cm×40 cm)底部的中央区域。利用旷场工作站(MED Associates, Georgia, VT, USA)，连续采集并分析15 min内小鼠的平均速度、运动总距离等指标。

1.4.2 爬杆实验

自制爬杆装置^[8]，并对各组小鼠进行爬杆训练。MPTP末次注射后的次日进行爬杆实验。将小鼠头朝上，上肢放在杆顶端(高80 cm，直径1 cm)。小鼠从放置到全身朝下的时间为掉头时间，从放置到后肢着陆的时间为总时间。每只小鼠测试3次，每次测试间隔1 h以上。

1.4.3 悬挂实验

自制悬挂实验装置(中间铁丝直径2 mm，长50 mm；两端平台高35 cm)，将小鼠前爪放于铁丝中间以悬挂小鼠。记录180 s内小鼠掉落的次数以及到达两端平台的次数，并根据参考文献^[9]计算得分。小鼠的基础分数设为10分，每掉落1次减去1分，到达平台1次则加1分。小鼠中途掉落或者到达平台后将其重新悬挂，直至计时达到180 s。

1.5 蛋白免疫印迹

行为学实验结束后，对小鼠进行灌注并取材。取小鼠一侧新鲜脑组织，将纹状体剥离并加入适量的含PMSF的RIPA裂解液匀浆后，4℃、12 000 r/min，离心15 min。取上清液，采用BCA法测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳分离蛋白，将分离的蛋白质转移至0.45 μm的PVDF膜上。5%的脱脂牛奶封闭膜120 min以抑制非特异性结合。随后按照蛋白分子量裁剪目标条带，对应TH抗体和β-actin抗体4℃冰箱摇床孵育过夜。次日，TBST清洗3次后，将目标条带与对应种属的二抗室温孵育1 h，蛋白印迹智能成像系统扫描。

1.6 免疫荧光

取小鼠另一侧半脑，放入4%的多聚甲醛中固定24 h后，参考小鼠脑图谱制备小鼠脑组织黑质区的石蜡切片。将石蜡切片放入二甲苯中脱蜡后，放入不同梯度的乙醇中水合。随后将切片置于pH 6.0的柠檬酸钠缓冲液中煮沸修复8 min，用组化笔在脑组织周围画阻水圈，向阻水圈内滴加免疫荧光封闭液，37℃封闭2 h后，加入TH抗体于4℃冰箱孵育过夜。次日，PBST清洗后加入免疫荧光二抗，放置于湿盒中37℃避光孵育30 min。用含DAPI的抗荧光淬灭剂封片后，在荧光显微镜下观察。

1.7 尼氏染色

将小鼠脑组织黑质的石蜡切片依次放入二甲苯和梯度乙醇中脱蜡和水合。在切片上滴加甲苯胺蓝染液染色5 min，流水洗净。加入1%的冰醋酸适当分化后，二甲苯中透明5 min并用中性树胶封片。

1.8 氧化应激指标测定

取适量的小鼠纹状体组织，加入9倍预冷的生理盐水于冰上制备10%的组织匀浆，随后3 000~4 000 r/min，离心匀浆液10 min，取上清液并严格按照说明书操作，进行氧化应激指标GSH、SOD、T-AOC、MDA的检测。

1.9 统计学方法

使用SPSS 21.0软件和GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析。计量资料用均数±标准差()表示，多组间比较采用单因素方差(One-Way ANOVA)分析。检验水准取双侧α＝0.05，以P < 0.05为差异有统计学意义。Adobe Illustrator CC 2018绘图。

2 结果 2.1 漆黄素对MPTP诱导的PD模型小鼠行为学障碍的影响

旷场实验结果发现，MPTP组小鼠的总运动距离和平均速度低于control组，而漆黄素+MPTP组小鼠的总运动距离和平均速度都有提高(图 1A、图 1B)。与control组相比，MPTP组小鼠的爬杆及掉头动作较慢，漆黄素+MPTP组小鼠的总运动时间和掉头时间均缩短(图 1C、图 1D)。悬挂实验中MPTP组小鼠的掉落次数增多，而到达平台的次数减少，总评分更低，而漆黄素干预能改善PD小鼠悬挂实验的掉落情况(图 1E)。

2.2 漆黄素对MPTP诱导的小鼠黑质区神经元损伤的影响

Nissl染色结果发现，control组小鼠黑质区神经元核仁及Nissl体呈浅蓝色且细胞结构完整，而MPTP模型小鼠黑质区神经元呈固缩深染状态。与MPTP组相比，漆黄素干预可显著改善小鼠黑质区的神经元损伤情况。见图 2。

2.3 漆黄素对MPTP诱导的小鼠TH水平下降及阳性神经元丢失的影响

免疫荧光结果发现，相比于control组，MPTP组TH阳性神经元的数量下降，表明PD模型构建成功。而给予漆黄素处理后小鼠黑质区的TH阳性神经元较MPTP组增多。蛋白免疫印迹结果显示MPTP组小鼠TH蛋白水平相较于control组下降，而漆黄素干预能缓解MPTP诱导的TH水平下降。见图 3。

2.4 漆黄素对MPTP诱导的PD模型小鼠氧化应激的影响

与control组相比，MPTP组小鼠的MDA含量升高，而GSH、SOD、T-AOC水平较control组下降；而漆黄素灌胃处理后MDA含量下降，GSH、SOD、T-AOC水平升高(P < 0.05)。见图 4。

3 讨论

PD病理机制中的多巴胺代谢、线粒体功能障碍、蛋白质错误折叠及神经炎症均可导致DAn神经元发生氧化应激损伤^[10]，而细胞氧化还原失衡后的ROS累积会导致脂质、蛋白质、DNA和RNA的氧化损伤，从而损害神经元功能和结构的完整性^[11]。

漆黄素具有抗癌、抗炎、抗病毒、免疫调节等多种生物学特性^[12]。已有研究表明，漆黄素可通过激活ERK改善与SOD1基因突变相关的肌萎缩性侧索硬化症模型的氧化应激所致病理损伤^[13]。

本研究通过旷场实验、爬杆实验以及悬挂实验评估小鼠的自主活动状态、有无运动迟缓以及运动协调性。行为学结果发现，漆黄素处理可改善MPTP小鼠的总运动距离，同时其平均速度提高、掉头时间及总时间缩短以及悬挂评分提高。

酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)是多巴胺合成的关键酶，常用于验证PD模型的成功建立及PD病理严重程度的评估。通过免疫荧光结果发现，漆黄素可显著提高MPTP诱导的TH水平，并增加TH阳性神经元数量。神经元损伤时，典型形态变化可用Nissl染色检测，表现为神经元萎缩及嗜碱性异常。尼氏染色结果发现漆黄素可显著缓解TH阳性神经元损伤。笔者认为，漆黄素可有效改善MPTP诱导的PD模型小鼠的行为学障碍和多巴胺能神经元损伤。

GSH的主要功能是针对脑组织存在的自由基进行防御。GSH水平降低可能会阻碍H₂O₂清除并促进强的羟自由基的形成，导致氧化损伤^[14]。SOD是清除活性氧自由基的主要酶，T-AOC反映机体酶类和非酶类抗氧化物的总水平^[4]。SOD、GSH、T-AOC水平的高低反映了机体清除自由基和抗氧化损伤的能力^[15]。丙二醛(MDA)是多不饱和脂肪酸氧化的最终产物，其水平可以间接反映氧自由基的代谢程度，因此可以作为氧化损伤的指标^[17]。MPTP诱导的小鼠中MDA水平升高表明氧化应激所产生的自由基增加。本研究结果发现，MPTP组小鼠脑组织中MDA含量升高，而GSH、SOD、T-AOC水平下降。漆黄素处理可使MPTP小鼠脑组织的GSH、SOD、T-AOC水平升高，MDA含量下降，表明漆黄素可以改善MPTP诱导的PD小鼠脑内ROS产生与清除之间的失衡，改善MPTP小鼠脑组织的氧化损伤。

综上，漆黄素可抑制MPTP诱导的多巴胺能神经元损伤，有效改善PD模型小鼠的运动功能障碍。漆黄素的上述神经保护作用可能与其清除自由基、抑制氧化应激密切相关。基于以上研究结果，漆黄素有可能成为预防和治疗PD的潜在神经保护药物。