缺血性脑卒中(ischemic stroke, IS)是最常见的卒中类型，具有发病率高、死亡率高、致残率高、复发率高等特点，其发病受多基因遗传因素影响^[1]。中枢神经系统存在大量微小RNAs(microRNAs, miRNAs)，参与神经细胞的发育、分化和生理功能调控^[2]。miRNAs的表达失调与IS的炎症、兴奋性毒性、氧化应激、凋亡、血脑屏障损伤、血管生成等病理生理过程相关^[3]。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)是基因组水平上因单个核苷酸的变异/突变所引起的DNA序列多态性，是人类基因组最普遍的基因突变。IS相关基因3'端非编码区(3'-untranslated region, 3'-UTR)的SNPs影响miRNAs与靶基因相互作用，这些SNPs与IS易感性及预后存在关联。因此，对IS相关基因3'-UTR的SNPs进行研究，探索其在IS发生、发展过程的作用以及其对治疗和预后影响，对明确IS遗传分子学机制、制定防治策略具有重要意义。

1 miRNA靶位点的SNPs

miRNAs是一组内源性非编码小分子单链RNA，其生物合成过程包括微处理复合物的加工、核输出和Dicer酶处理，成熟的miRNA与AGO(Argonaute)蛋白形成RNA诱导的沉默复合物(RNA induced silencing complex, RISC)。miRNAs可与基因启动子区域结合，对组蛋白进行修饰，在转录水平上调控基因表达；通过RISC与靶mRNA 3'-UTR区完全或不完全互补配对，使靶mRNA降解，从而引起靶基因翻译抑制，最终参与调控下游分子信号通路。已有研究证实靶基因3'-UTR存在SNPs，这些SNPs通过改变原有miRNAs的结合位点或产生新结合位点，影响miRNAs对基因的转录后调控, 导致相关基因的表型改变^[4]。

2 IS相关基因3'-UTR的SNPs

随着生物遗传信息学的发展及全新的检测手段，目前已有许多关于IS相关基因编码区SNPs的功能性研究，但位于miRNAs结合位点3'-UTR SNPs与IS关联性及功能性研究相对较少。现已报道与IS相关且3'-UTR存在SNPs的基因有血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、白细胞介素-1(interleukin-1, IL-1)、NOD样受体家族蛋白3(nod-like receptor protein 3, NLRP3)、亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR)、对氧磷酶1(paraoxonase1, PON1)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)、C反应蛋白(C-reaction protein, CRP)和组蛋白去乙酰化酶9(recombinant histone deacetylase9, HDAC9)。

2.1 VEGF

VEGF是血管生成和内皮细胞增殖的主要调节因子，参与神经保护、神经发生、血管生成、血管修复^[5-6]。VEGF基因3'-UTR存在多个SNPs，包括rs3025040、rs3025039、rs10434、rs3025053，其中rs3025040、rs3025039已被证实与IS相关。有研究表明，rs3025039与VEGF的表达水平相关^[7]，Binod等^[8]的病例对照研究发现rs3025039与IS风险增加相关。而Zhao等^[9]的研究结果表明，rs3025039基因型与IS的易感性及卒中严重程度无显著关联，但rs3025039 TC+TT基因型与CC基因型相比预后不良的风险增加1.99倍。该研究观察到rs3025040与rs3025039表现出很强的连锁不平衡(r₂=1.0)。进一步荧光素酶分析发现，rs3025040 T等位基因显著降低4种细胞的荧光素酶活性，表明rs3025039影响miR-199a和miR-199b与rs3025040多态位点VEGF mRNA的结合，导致VEGF的低水平表达，从而增加IS预后不良的风险。

2.2 IL-1

IL-1是脑缺血损伤后关键的炎症调节因子，主要通过IL-1α和IL-1β两种亚型起作用^[10]。Wang等^[11]的病例对照研究发现年龄、高血压、血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、rs3783553 ins/ins基因型是IS的独立危险因素。进一步实验证明，rs3783553影响miR-122与IL-1α mRNA的结合，导致IL-1α水平升高，最终增加IS的患病风险。Yang等^[12]通过病例对照研究和体外细胞实验发现，IL-1β-511 TT/CC基因型通过调节NF-κB miRNA、iNOS、MMP-2和Bax蛋白表达影响IS的发病风险。

2.3 NLRP3

NLRP3炎症体在小胶质细胞、星形胶质细胞、神经元、内皮细胞等细胞中多样性表达，可通过激活免疫炎症反应参与动脉粥样硬化、心肌梗死和IS的病理生理过程^[13-14]。据报道NLRP3 mRNA 3'-UTR中含有miR-223结合位点，在小胶质细胞激活过程中miR-223可下调NLRP3表达，通过Caspase-1和IL-1抑制炎症反应、减轻脑水肿及改善神经功能^[15]。rs10754558多态性位于NLRP3的3'-UTR，Zhu等^[16]发现，NLRP3 rs10754558 G等位基因可能干扰miR-223主要的结合位点，影响mRNA与miR-223结合，从而上调NLRP3的转录。该实验结果表明，NLRP3 rs10754558可能影响中国汉族人群的IS的患病风险，但缺乏在其他人群复制研究和体内功能学实验验证。

2.4 MTHFR

MTHFR是同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)和叶酸代谢的关键酶，降低MTHFR酶活性可增加血浆Hcy水平，降低血浆叶酸水平，促进卒中的发展。Jung等^[17]通过病例对照研究发现，MTHFR 3'-UTR rs4846049和rs4846048与心源型IS的患病风险显著相关(MTHFR rs4846049 CC vs CA+AA: OR=2.145, 95%CI=1.203~3.827, P=0.010; MTHFR rs4846048 TT vs CC: OR=10.146, 95%CI=1.297~79.336, P=0.027)。He等^[18]以500名IS患者和600名健康对照者为研究对象，检测MTHFR 3'-UTR五个SNPs，发现其中rs868014 TC/CC基因型与IS的患病风险和短期不良预后显著相关。进一步实验证明，MTHFR rs868014 TC/CC基因型可促进miR-1203结合，导致MTHFR在细胞中低水平表达，增加罹患IS的风险。Shi等^[19]研究发现，MTHFR rs141884651 GA/AA基因型与IS的患病风险显著相关(GA基因型OR=0.68，95%CI=0.22~0.87，P=0.02；AA基因型OR=0.45，95%CI=0.29~0.58，P=0.001)，A等位基因为IS保护因素(OR=0.57, 95%CI=0.29~0.69, P=0.002)。根据双荧光素酶测定，rs141884651减弱let-7f和miR-196a与靶基因mRNA的结合，从而负向调节MTHFR表达。

2.5 PON1

PONs是钙依赖性水解酶家族，主要由PON1、PON2和PON3基因组成，PON1基因多态性占个体间变异的60%以上^[20]，PON1的SNPs与冠状动脉疾病、糖尿病、IS等多种疾病相关^[21-22]。Liu等^[23]研究发现，PON1 rs3735590不同基因型(CC、CT、TT)的miR-616和PON1的结合存在差异，C等位基因通过干扰mRNA-miRNA结合导致PON1的低表达，从而增加IS的患病风险。

2.6 BDNF

BDNF是神经营养蛋白家族成员，参与调节正常神经元活性和卒中后恢复，包括细胞增殖和分化、轴突和树突生长、突触可塑性、血管生成以及周围和中枢神经元的发生^[24]。Liu等^[25]通过病例对照研究发现，BDNF 3'-UTR rs712442与IS的短期预后相关，利用荧光素酶测定证实，rs712442多态性改变miR-922与BDNF mRNA的结合，使得TC或CC基因型患者相对TT基因型的BDNF的表达水平升高，从而帮助神经功能的恢复，其结果表明rs712442可能是IS短期预后的保护因素。

2.7 CRP

CRP是由肝脏合成的血浆蛋白，通常被认为是一种炎性标记物，是IS功能预后的独立预测因子^[26]。Elena等^[27]通过生物信息学分析选取了30个炎症相关基因的68个SNPs，在1987例IS患者和698例健康对照中进行筛查，发现，包括CRP 3'-UTR rs1205在内的3个SNPs与心源型卒中相关。而Wu等^[28]实验表明，rs1205杂合子携带者的IS患病风险显著低于野生纯合基因型。Zhang等^[29]纳入378例IS患者和613例健康对照组进行研究，检测包括rs1205在内的4个CRP SNPs，结果显示其中3个SNPs(rs876537、rs1205和rs3093059)与血浆CRP水平显著相关。以上实验均对CRP rs1205做了人群的基因分型研究，但缺乏其机制的实验证据。

2.8 HDAC9

HDAC9主要介导调节乙酰化和去乙酰化，通常在脑和骨骼肌中高水平表达，可通过增加炎症反应、细胞凋亡、内皮细胞通透性障碍以及降低紧密连接蛋白的表达，导致氧―葡萄糖剥夺，从而诱导脑微血管内皮细胞功能障碍^[30]。最近的几项全基因组关联分析(genome-wide association study, GWAS)数据已经确定，HDAC9基因多态性与大血管IS密切相关^[31]。Rainer等^[32]通过分析来自欧洲、澳大利亚和南亚共3127例IS患者和9778例正常对照的基因，确认HDAC9是大动脉粥样硬化型脑梗死(large-artery atherosclerosis stroke, LAS)的主要危险基因，并发现3'-UTR rs2023938与LAS相关。

3 其他IS相关基因miRNAs靶位点的SNPs

目前仍有许多卒中相关基因待确定，最近一项GWAS研究共总结了214个基因，其中包括120个卒中相关基因，62个可能导致卒中但暂无卒中患者人群研究的相关基因以及来自GWAS最新报道的32个卒中相关的基因可用于临床表型描述^[33]。国际卒中遗传学联盟发起一项超过52万人的队列研究，该研究鉴定了32个与卒中发病机制密切相关的基因，其中10个在国际研究中曾被报道，而其余22个是既往未经报道的卒中相关的基因区域^[34]。但目前的研究重点多放在全基因组测序和对外显子的检测，非编码区(包括3'-UTR)的多态性尚未被重视，卒中相关基因3'-UTR SNPs与IS易感功能性研究也有待进一步探索。

4 miRNAs及其结合位点SNPs在IS的治疗

miRNA与靶基因结合可能改变药物反应蛋白的表达，影响药物的吸收、代谢以及分布，miRNAs结合位点的SNPs可能导致耐药或药物敏感^[35]。Sennblad等^[36]利用计算机模拟预测工具设计了4个FXI 3'-UTR SNPs单倍型，探索miR-145或miR-181对FXI调节机制，其实验结果显示miR-145或miR-181的过表达可显著降低含有FXI 3'-UTR质粒转染细胞的荧光素酶活性，表明miR-145或miR-181通过靶向F11 mRNA的3'-UTR调节FXI的表达水平，但未发现这些SNPs对miRNA-mRNA的结合具有功能性作用。该研究结果为预防血栓提供新的治疗方向，使miRNAs拮抗剂治疗IS成为可能。

5 结语与展望

目前对miRNAs靶基因3'-UTR的SNPs与IS的研究主要包括关联性分析和功能验证两方面，通过将人群研究与体内外实验研究相结合，以期发现SNPs与IS关联的同时探索其分子生物学机制。但是一个miRNA可以调控多个靶基因，一个基因也可受到多个miRNAs的调控；miRNAs靶基因可参与IS的不同信号通路，形成复杂的调控网络。目前有关miRNAs的研究主要集中在单个miRNA与其靶基因及SNPs之间的功能验证上，然而对miRNAs的调控网络进行探索才能详细了解其复杂的转录后调控机制，以期为IS的诊断、治疗、预后提供更有价值的科学依据。