小胶质细胞是中枢神经系统中最重要的天然固有免疫细胞^[1]。在生理状态下，小胶质细胞在神经系统具有保护、支持、营养和修复等重要作用；而在病理状态下，小胶质细胞被迅速激活成M1和M2两种表型。其中，M1表型释放促炎介质导致组织损伤；M2表型释放抗炎介质帮助损伤组织修复。晚期炎症持续刺激免疫细胞的活化，最终导致神经系统的不可逆损伤^[1-2]。在阿尔茨海默病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、帕金森病和多发性硬化等各种神经退行性疾病中，最显著的共同特征之一是持续激活状态下的小胶质细胞介导的神经炎症反应，而这一反应会导致或者加重神经元的退化、变性甚至死亡^[3-4]。因此，小胶质细胞介导的炎症反应在各种神经退行性疾病的病理生理过程中发挥着极其重要的作用。

京尼平(genipin)是茜草科植物栀子的主要活性成分，为栀子苷中提取的苷元^[5]。京尼平具有多种药理活性，包括抗炎、抗氧化应激，抗凋亡和抗血管生成等作用，被认为可用于治疗糖尿病、癌症及各种炎症相关性疾病^[6-11]。

脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是常用的炎症和凋亡反应诱导剂，包括在神经、肝脏、肾脏等系统^[12]。有研究表明，京尼平可减轻脂多糖引起的小鼠记忆功能减退以及持续小胶质细胞炎性活化^[13-14]。凋亡是对神经炎症产生的重要适应性反应。因此，本研究旨在神经系统中，进一步明确京尼平对脂多糖诱导小胶质细胞炎症和凋亡的作用及其机制，为京尼平应用于神经退行性疾病临床治疗的提供更多的基础试验支持。

1 材料与方法 1.1 材料

京尼平，质量分数大于98%，购自美国Santa Cruz Biotechnology公司；LPS和ELISA检测试剂盒购于Sigma公司；DMEM培养基、胎牛血清均购自HyClone公司；Anti-β-actin抗体、Anti-Bax抗体、Anti-Bcl-2抗体均购自Santa公司；BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 BV-2小胶质细胞的培养

BV-2小胶质细胞购自中国医学科学院基础医学研究，并使用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基在37℃、5%CO₂细胞培养箱传代培养。

1.3 主要试剂配制

将京尼平粉末按照10 mM浓度于37℃、超声波搅拌下，溶解于DMEM培养基中，并用0.22 μm微孔滤膜过滤后，置于冰盒上低温避光保存，现配现用。LPS粉末按照1 mg/1 ml DMEM的浓度，70~80℃下涡旋振荡溶解，0.22 μm微孔滤膜过滤后，-80℃避光保存。

1.4 实验分组及预处理方式

细胞分为4组：①对照组：完全培养基中培养24 h；②京尼平组：用含5~20 μmol/L浓度京尼平的完全培养基培养12 h后，再置于正常完全培养基中培养24 h；③LPS组：置于终浓度为1 μg/mL的LPS培养基中培养24 h；④京尼平+LPS组：先加入浓度10 μmol/L京尼平作用12 h后，再置于终浓度为1 μg/mL的LPS培养基中培养24 h。

1.5 MTT法

小胶质细胞BV-2接种于96孔板，待细胞融合度达到50%左右，用不同浓度的京尼平处理细胞12 h后，使用移液枪加20 μL MTT(5 μg/mL)到每个细胞孔板中孵化4 h，然后去掉上层清液，加入200 μL DMSO溶液溶解甲瓒晶体。用酶联免疫检测仪于570 nm波长处测定其光吸收值。

1.6 酶联免疫吸附法

根据酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒说明书方法测定各组细胞上清液中的IL-1β、IL-6和TNF-α因子含量。

1.7 Western Blot

各组小胶质细胞加入RIPA裂解液裂解，低温高速离心机4℃预冷，12 000 rpm高速离心10 min，用BCA法测定蛋白浓度，每孔以40 μg样品上样进行SDS-PAGE，转膜(PVDF膜)1 h，5%脱脂奶粉封闭2 h，孵育I抗(Bax、Bcl-2浓度为1 :500~1 :1 000，β-actin浓度为1 :3 000)4℃过夜，II抗37℃1 h，ECL发光试剂进行化学显色，Fusion Imaging软件分析蛋白表达水平。

1.8 细胞流式学检测

待细胞处理时间结束后，用0.25%的胰酶消化细胞约1 min，吸取细胞悬液放入10 mL离心管中离心弃除上清液。再用PBS轻柔清洗并离心3次，最后用400 μL的冰PBS将细胞重悬，根据FITC-Annexin说明书检测细胞凋亡，用Cell Quest Pro软件获取各实验分组数据，用Mod Fit软件对数据进行分析细胞的凋亡率。

1.9 RT-PCR

采用Trizol法提取总RNA，然后用ThermoNanoDrop 2000软件检测目的RNA浓度并计算100 ng RNA的体积量，再用逆转录酶进行逆转录，最后用PCR进行基因扩增。引物设计与合成，引物序列见表 1。

扩增条件为：第一步95℃ 30 s；第二步95℃ 10 s，58℃ 31 s，72℃ 30 s重复40个循环；第三步95℃ 15 s，60℃ 30 s，95℃ 15 s；用GAPDH作内参，计算目的基因mRNA的相对表达量，通过2^-△△CT法计算每个样品TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达量。

1.10 统计学分析

使用SPSS 15.0软件进行统计学分析。实验数据用均数±标准差(x±s)表示，每组实验至少重复三次，组间比较采用单因素方差分析。P < 0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 京尼平对LPS诱导的小胶质细胞毒性的抑制效应

采用MTT法检测京尼平对BV-2细胞活性的影响。结果表明LPS导致小胶质细胞的活性降低，而0~10 μM浓度范围内的京尼平以剂量依赖的方式减轻了LPS诱导的细胞毒性反应，但京尼平在20 μM浓度时对细胞毒性增加。因此，10 μM浓度的京尼平被用于后续研究。见图 1。

2.2 京尼平抑制LPS诱导的小胶质细胞炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6释放

小胶质细胞是参与脑内炎症反应的主要免疫细胞，因此，为了进一步了解小胶质细胞是否介导了炎症因子的释放，我们通过ELISA法对上清培养基中的TNF-α、IL-1β和IL-6因子的释放量进行了测定。结果表明，仅用LPS处理BV-2细胞，TNF-α、IL-1β和IL-6的释放显著增加，而京尼平可以有效抑制LPS诱导的TNF-α、IL-1β和IL-6产生。见表 2。

2.3 京尼平抑制LPS诱导的小胶质细胞炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6转录

为了进一步验证京尼平对炎症因子的作用，我们测定了细胞内TNF-α、IL-1β和IL-6的转录水平变化。研究结果显示，BV-2细胞在LPS的刺激下，细胞炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达水平显著增加。京尼平干预处理后，与LPS组相比，TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达水平明显降低(图 2)。这也进一步证实了，小胶质细胞作为固有免疫细胞介导了炎症因子的转录及释放，而京尼平能够有效干预这一过程。

2.4 京尼平对LPS诱导的凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达水平的影响

通常，适应性增加的凋亡反应可以清除堆积的炎症因子，因此，我们测定了凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达水平。Western Blot实验结果显示，在LPS刺激BV-2细胞24 h后，促凋亡蛋白Bax表达水平明显增高，而抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平明显降低(图 3)。京尼平预处理后，可以明显抑制LPS诱导的Bax和Bcl-2蛋白表达量的变化。这一结果初步表明，LPS除了诱导小胶质细胞的炎症反应，还可以引起促凋亡反应，而京尼平能够有效阻断凋亡反应的产生。

2.5 京尼平对LPS诱导的小胶质细胞凋亡率的影响

为了进一步明确LPS诱导的凋亡反应对小胶质细胞本身的影响，以及京尼平在该病理生理过程中作用，我们采用了流式细胞术对凋亡细胞进行分类及计数。实验结果显示(图 4)，LPS刺激BV-2细胞24 h后，BV-2细胞凋亡率明显增加，京尼平预处理后，细胞凋亡率显著下降，该结果与上述凋亡相关蛋白测定所得出的结论一致。

3 讨论

在阿尔茨海默病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、帕金森病和多发性硬化等多种神经退行性疾病中，中枢神经系统慢性炎症是其重要病理特征之一^{[3, 15]}。大量研究表明，通常在这些神经退行性疾病的病变周围，通常能发现被活化的小胶质细胞。小胶质细胞是神经元变性和坏死的效应因子，参与坏死神经元的清除。但持续活化的小胶质细胞可释放IL-6、IL-1β和TNF-α等炎症细胞因子，加速多种神经退行性疾病的疾病进展^{[2-4, 16]}。因此，小胶质细胞介导的炎症被认为是神经退行性疾病发生或恶化的可能机制。

有研究结果显示，京尼平具有抗炎作用，值得注意的是，已有实验证实京尼平具有中枢神经系统抗炎作用^{[7, 13]}。本研究表明LPS诱导的急性神经炎症，可导致BV-2细胞的炎症因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)的转录和释放增加；而京尼平预处理可以部分抑制炎症因子的激活，与既往实验结果一致。这表明，京尼平能对LPS刺激的BV-2小胶质细胞发挥抗炎作用。同时，本研究还发现，LPS可以导致小胶质细胞的凋亡增加，通常，适应性增加的凋亡反应可以清除堆积的炎症因子。而京尼平作用后，LPS诱导的凋亡反应减轻，我们推测这可能是京尼平减轻了炎症反应，而凋亡反应因此下调以与炎症反应的程度相适应。这也间接证实了京尼平对炎症的调控作用。

细胞凋亡的启动主要包括外源性凋亡途径和内源性凋亡途径，其中，外源性凋亡途径主要是由死亡受体和配体的结合启动，而内源性凋亡途径主要是由于线粒体外膜的通透化导致细胞色素c等凋亡因子的释放，从而结合Apaf-1激活caspase-9，最终导致caspase-3的激活触发细胞凋亡的发生。Bcl-2家族蛋白在线粒体外膜通透化中起着重要的调节作用，例如Bax/Bcl-2的比例失衡可以引起细胞线粒体外膜的通透化，导致内源性凋亡途径的激活，最终导致凋亡的发生^[17-18]。本研究发现LPS刺激BV-2细胞后，可以促进促凋亡蛋白Bax的表达，同时减少抗凋亡蛋白Bcl-2的表达；而京尼平的干预可以有效的阻断该病例生理过程，从而减轻LPS刺激的BV-2细胞凋亡反应。

本实验结果表明，京尼平对脂多糖刺激小胶质细胞产生的炎症反应具有一定的调节作用。此外，本研究还发现，京尼平的干预可致小胶质细胞凋亡减少。结合此前的研究表明，京尼平有较好的血脑屏障透过性^[19]。所以，京尼平可能具有很好的临床应用价值。进一步阐明对京尼平在神经炎症反应中的作用及机制，以及药物安全性的相关研究，对于京尼平应用于神经退行性疾病临床治疗至关重要。