进展型脑梗死在临床上较为常见，指在发病后6 h~7 d内，虽经过住院积极治疗，但病情仍呈阶梯式进展或者病情稳定后出现复发甚至加重^[1]。进展型脑梗死在全部脑梗死病例中比例高达43%，属于一种难治性脑血管病，据相关文献报道，稳定型脑梗死的病死率约为8.60%，而进展型脑梗死的病死率为35%，增加3倍以上，严重威胁患者生命安全^[2]。虽然目前进展型脑梗死的诊治取得一定成果，但致残率及病死率仍很高，因此发现一种简单便捷、有效可行的早期诊断及判断预后方法显得尤为重要。微小RNA(miRNA)是目前国内外研究热点，有报道表示可通过外周血中某些特定miRNA水平变化反映脑梗死患者脑组织中miRNA水平变化，且外周血miRNA经反复冻融或者长期储存后仍具非常高的稳定性，因此有学者认为外周血miRNA可作为脑梗死等脑血管疾病新型的生物学标志物^[3-4]。miRNA-21、miRNA-223作为miRNA的重要亚型，目前鲜有其与进展型脑梗死的相关研究报道。因此，本文通过miRNA-21、miRNA-223旨在探讨进展型脑梗死患者miRNA的表达水平及其临床意义，为临床早期有效诊断进展型脑梗死及预后提供更佳的选择方向。

1 对象与方法 1.1 研究对象

本研究回顾性分析2016年7月至2018年7月期间我院收治的脑梗死患者病例138例。

纳入标准：⑴符合2014年《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2014》中的急性脑梗死诊断标准：①急性起病；②局灶神经功能缺损(一侧面部或肢体无力或麻木、语言障碍等)，少数为全面神经功能缺损；③症状或体征持续时间不等(当影像学有显示责任病灶时)，或持续24 h以上(当缺乏责任病灶时)；④排除非血管性原因；⑤脑CT/MRI排除出血；⑵发病6~24 h内入院(超溶栓时间窗)；⑶性别不限；⑷临床资料完整；⑸入院时NIHSS评分5~17分者。

排除标准：①脑膜肿瘤、脑内寄生虫病、颅脑外伤、颅内胶质瘤等；②合并其它感染或者应激情况；③合并严重肝肾功能不全、心律失常、自身免疫疾病等；④其它血液系统疾病；⑤患者资料不完整。

进展型脑梗死参考欧洲进展性卒中研究(EPSS)提出的进展性卒中的诊断标准。入选患者采用斯堪的那维亚卒中量表(Scandinavian Stroke Scale, SSS)作为评分标准；进展型脑梗死指发病72 h内有神经系统损害进行性加重者；发病72 h内有意识水平、上肢、下肢或眼球运动降低≥2分和(或)语言功能降低≥3分者，否则入对照组(稳定型脑梗死组)。最终将所有研究对象分为对照组(稳定型脑梗死82例)和观察组(进展型脑梗死56例)。其中，观察组患者按照MESSS评分为30例轻度进展(0~15分)、17例中度进展(16~30分)、9例重度进展(31~45分)三个亚组。本研究经我院伦理委员会批准。

1.2 临床资料收集

收集所有患者临床资料，包括年龄、性别、发病时间、合并疾病种类(冠心病、高血脂、糖尿病、高血压等)，入院时SSS评分、MESSS评分、miRNA-21、miRNA-223水平等。并对观察组患者在出院两个月后进行短期预后随访(电话回访或门诊回访)，并根据随访信息及改良Rankin量表(mRS)将患者分为预后不良组(mRS>2)及预后良好组(mRS≤2)。

1.3 血清miRNA-21、miRNA-223水平检测

取患者入院后第2天清晨空腹静脉血4 mL，立即离心(3 500r/min)15 min，取上层清液并冷冻储存(-30℃)。统一取出血清样本并将细胞裂解，使用赛默飞世尔中国公司提供的总RNA提取试剂盒对血清样本中的总RNA进行提取，然后使用紫外分光光度计测定总RNA浓度，样品A260/A280≥1.80表示合格；使用赛默飞世尔中国公司提供的反转录试剂盒将总RNA反转录得到单链cDNA，后应用聚合酶链式扩增(PCR)试剂盒对单链cDNA进行PCR。PCR反应条件为95℃预变性30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，重复40个循环进行扩增反应；95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s制备溶解曲线。每份样品设置3个复孔。mRNA表达量采用标准曲线法进行计算。所有操作均严格按照说明书执行。

1.4 统计学方法

本研究使用SPSS 20.0软件对所有数据进行处理。计量资料用均数±标准差(x±s)表示，两组间比较采用成组t检验；多组间比较采用单因素方差分析；组间两两比较采用SNK-q检验。计数资料用率(%)表示，组间比较用χ²检验。采用多因素logistic回归分析脑梗死进展的危险因素。绘制受试者工作特征曲线(ROC)分析血清miRNA-21、miRNA-223表达水平预测进展型脑梗死预后的价值，曲线下面积(AUC)比较采用Z检验。采用Spearman法进行相关分析。以P < 0.05表示差异有统计学意义。

2 结果 2.1 两组组患者基线资料比较

对照组和观察组患者在性别、年龄、斑块Crouse积分、吸烟史、饮酒史、合并糖尿病及冠心病等基线资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，有可比性。观察组的高血压、高血脂比例及miRNA-21、miRNA-223水平均显著高于对照组，差异有统计学意义(P < 0.05)。见表 1。

2.2 进展型脑梗死相关影响因素logistic分析

以是否为进展型脑梗死(否=0，是=1)为因变量，以高血压、高血脂、miRNA-21及miRNA-223表达水平为自变量，进行logistic回归分析，结果显示miRNA-21及miRNA-223高表达是进展型脑梗死的危险因素(P < 0.05)。见表 2。

2.3 进展型脑梗死严重程度与miRNA-21、miRNA-223水平相关性分析

中度组、重度组患者的miRNA-21、miRNA-223水平显著高于轻度组，重度组的miRNA-21、miRNA-223水平显著高于中度组，差异有统计学意义(P < 0.05)，血清miRNA-21、miRNA-223表达水平随病情加重而升高(表 3)。经Spearman相关性分析，进展型脑梗死严重程度与血清miRNA-21、miRNA-223表达水平呈正相关(r=0.834, P=0.008; r=0.896, P=0.001)。

2.4 两个月预后不良组与预后良好组miRNA-21、miRNA-223表达水平比较

两个月后对56例进展型脑梗死患者进行随访，发现36例预后良好(预后良好组)，20例预后不良(预后不良组，包括9例复发、2例死亡)。预后不良组患者血清miRNA-21、miRNA-223表达水平显著高于预后良好组，差异有统计学意义(P < 0.05)。见表 4。

2.5 血清miRNA-21、miRNA-223表达水平预测进展型脑梗死预后的ROC曲线分析

血清miRNA-21、miRNA-223表达水平预测进展型脑梗死预后的AUC面积分别为0.805、0.834。见图 1、表 5。

3 讨论

进展型脑梗死的病因及病理极为复杂，通常情况下，进展型脑梗死发病突然、进展快，若得不到及时有效的诊断，极可能会耽误最佳治疗时机。因此，便捷有效的早期诊断方法和预测生物标志物可极大帮助临床作出正确治疗方案并对患者预后做出准确判断。目前，多数观点认为动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是脑梗死的主要病理学基础，而炎症反应在AS的发生发展过程中具有重要影响^[5-6]。有专家提出，AS可视为一种慢性炎症性疾病，许多炎症因子及相关细胞均参与其中^[7]。一方面，病情发展会促进炎症反应加剧，另一方面，炎症反应反过来加快病情恶化。戚游等^[8]发现，进展型脑梗死患者肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、IL-8表达水平显著高于稳定型脑梗死患者，且病情越严重其表达水平越高，呈正相关性。可见，TNF-α、IL-6、IL-8等参与的炎症反应也是影响进展型脑梗死预后的重要原因。

miRNA是一种内源性非编码小分子RNA，在不同组织和不同疾病中的表达水平不同，而外周血中miRNA表达水平的检测相对于组织中miRNA的检测更简单便捷，且miRNA血清样本在极低温度下(低于-80℃)仍能保存完好，此为miRNA作为血液学诊断标记的重要优势^[9-11]。

miRNA-21是近年来发现的与脑梗死相关miRNA，在动脉粥样硬化中出现显著上调，可提高细胞对脂类的摄取，提升炎性细胞分子的分泌，导致细胞坏死进而形成噬斑，进而形成动脉粥样硬化。miR-223在血小板中高表达，并参与血小板功能的调控，在血栓性心脑血管疾病的病理生理过程中发挥重要作用。本研究经过单因素分析及多因素logistic回归分析发现，进展型脑梗死患者的miRNA-21、miRNA-223表达水平均显著高于稳定型脑梗死患者，miRNA-21、miRNA-223的高表达均是进展型脑梗死的危险因素，其原因可能是miRNA-21、miRNA-223参与了进展型脑梗死的病理发展过程。曹琳等^[12]研究发现，ACI患者miRNA-21表达明显上调，与IL-10等炎性因子水平呈正相关，是ACI早期诊断和判断病情严重程度的重要标志物。虞莉娜等^[13]亦发现miRNA-21参与ACI的病理生理学过程，miRNA-21水平高低与ACI的病情程度和恢复情况密切相关。

有研究表示，动脉粥样硬化患者miRNA-223的表达明显高于正常对照，且Gensini评分与miRNA-223表达显著相关^[14]。本研究发现，进展型脑梗死的严重程度与血清miRNA-21、miRNA-223的表达水平均呈正相关，说明miRNA-21、miRNA-223参与急性脑梗死的炎症反应。既往研究亦发现^[15-17]，急性脑梗死患者血清miRNA-21、miRNA-223表达水平显著高于健康人群，且TNF-α水平与miRNA-223水平呈正相关，IL-10、TNF-α/IL-10与miRNA-21、miRNA-223表达水平均呈正相关，miRNA-21、miRNA-223在血清中高表达与进展型脑梗死严重程度呈正相关，其原因可能是血脑屏障在脑梗死发病时遭到破坏，脑特异性的miRNA-21、miRNA-223穿过遭受破坏的血脑屏障进入外周血，且病情越严重，其表达越高^[18-19]。可见，血清中miRNA-21、miRNA-223表达水平可作为进展型脑梗死的生物学标志物，同时有助于评估病情严重程度。

同时，本研究对进展型脑梗死患者两个月后的随访发现，预后不良组患者血清miRNA-21、miRNA-223表达水平显著高于预后良好组。且经ROC曲线分析显示，miRNA-21、miRNA-223的表达水平预测进展型脑梗死预后的AUC面积分别为0.805、0.834，并分别得出截断值4.45(敏感度=77.14%，特异性=82.28%)、7.06(敏感度=82.86%，特异性=73.42%)。可见miRNA-21、miRNA-223的表达水平对预测进展型脑梗死预后均具有较高的敏感度和特异度。同时结果提示，当miRNA-21表达>4.45及miRNA-223>7.06时，应提早予以相应有效的干预措施。

本研究尚存在缺陷，主要是样本量较小，且属回顾性研究，因此仍需更大规模样本更具前瞻性的研究予以进一步证实。

综上所述，进展型脑梗死患者miRNA-21、miRNA-223呈高表达，且其表达水平与脑梗死严重程度呈正相关，同时对预测进展型脑梗死预后均具有较高的敏感度和特异度，具有极高的临床价值，可作为一种便捷有效地早期诊断和预测进展型脑梗死的生物标志物。