急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke, AIS)是老年人群常见的中枢神经系统血管疾病，其发病率、致残率及死亡率均较高，已成为世界范围内致死和致残的主要原因之一^[1]。随着我国经济的发展和人民生活水平的提高，人口老龄化越来越明显，而老年AIS的发病率在逐年增加，给社会及患者家庭带来了沉重的负担^[2]。微小核糖核酸(microRNA, miRNA)作为一种在真核生物中高度保守的非编码小分子RNA，通过调节基因表达参与脑卒中的发生发展，有望作为AIS诊断及预后的潜在生物学标志物^[3]。近年来的研究发现，miR-150-5p及miR-148b-3p在AIS中存在异常表达，参与调控AIS的病理生理过程，为AIS的治疗提供了新的靶点^{[4, 5]}。但miR-150-5p及miR-148b-3p能否成为AIS辅助诊断的新型生物学标志物，目前尚未明确。本研究通过检测老年AIS患者血清miR-150-5p及miR-148b-3p表达水平，探讨miR-150-5p及miR-148b-3p对老年AIS诊断的价值，旨为在老年AIS的诊断及靶向治疗提供参考依据。

1 对象与方法 1.1 研究对象

收集2016年1月1日至2018年12月31日在中国人民解放军联勤保障部队第九八〇医院收治的老年AIS患者178例，其中男性121例，女性57例，年龄65~86岁，平均年龄(76.20±6.58)岁。

纳入标准：①符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南(2014年)》^[6]诊断标准，且年龄≥65岁；②在发病24 h内入院，且经头颅CT或MRI检查显示有缺血性病灶。

排除标准：①出血性卒中、脑外伤、高血压脑病、脑炎及其他种类的脑血管疾病者；②存在严重心肺疾病、肝肾功能不全、严重感染、多发性硬化、恶性肿瘤及血液系统疾病者；③合并有意识障碍或精神症状者。

另选择同期我院健康体检正常者65例作为对照组，其中男性45例，女性20例，年龄65~85岁，平均年龄(75.90±6.42)岁。

本研究经我院伦理委员会批准，并与患者或家属签署知情同意书。

1.2 研究方法

采用前瞻性研究方法。根据美国国立卫生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale, NIHSS)评分评估患者的神经功能缺损程度，其中 < 5分为轻度神经功能缺损，52例(轻度组)；5~20分为中度神经功能缺损度，83例(中度组)；>20分为重度神经功能缺损，43例(重度组)。记录所有研究对象的一般资料，包括年龄、性别、体质量指数、基础疾病、心率及血压等。

1.3 miR-150-5p及miR-148b-3p检测

所有患者均于入院当天抽取静脉血5 mL置于未加抗凝剂的肝素离心管中，于室温，2 500 r/min离心15 min，吸取上层血清400 μL，加入1 mL提取剂(Trizol)，于-70℃保存。

按照总RNA快速提取试剂盒说明书从中提取总RNA。在ABI 7500型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)上进行实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)。

以U6为内参，miRNA逆转录反应体系15 μL :5 μL RNA模板，3 μL U6及miRNA特异性茎环引物，0.15 μL的100 mmol/L脱氧核糖核苷酸(dNTPs)，1.00 μL逆转录酶(50 U/μL)，10×反转录缓冲液1.50 μL，0.19 μL RNase抑制剂(20 U/μL)，4.16 μL无菌三蒸水。反应条件：16 ℃ 30 min、42℃ 30 min、85℃ 5 min。

扩增反应体系为20 μL :1 μL引物及探针Mix(20×)，10 μL TaqMan通用混合物溶液(2×)，1.33μL反转录产物cDNA，7.67 μL无核酸酶的水。扩增条件：95℃预变性10 min，95℃变性15 s、60℃复性60 s进行45个循环。

每个反应体系中荧光信号达到设定阈值所经历的循环数即为Ct值，采用2^-△△Ct法计算miR-150-5p及miR-148b-3p的相对表达水平，其中△Ct=Ct_目的基因-Ct_U6。

1.4 统计学分析

采用SPSS 22.0统计软件分析。计量资料以均数±标准差(x±s)表示，多组间均数的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验检验；两独立样本均数的比较采用成组t检验。计数资料以百分率(%)表示，组间比较采用χ²检验。绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析血清miR-150-5p及miR-148b-3p表达水平对老年AIS诊断的价值，曲线下面积(AUC)比较采用Z检验。采用多因素logistic回归分析影响老年AIS的危险因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 AIS组和对照组的临床一般资料比较

AIS组和对照组的性别、年龄、体质指数、基础疾病、吸烟史、饮酒史、收缩压及舒张压比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表 1。

2.2 AIS组和对照组血清miR-150-5p及miR-148b-3p表达水平比较

AIS组血清miR-150-5p及miR-148b-3p表达水平明显低于对照组，差异均有统计学意义(P＜0.01)。见表 2。

2.3 不同神经功能缺损患者血清miR-150-5p及miR-148b-3p水平比较

重度组血清miR-150-5p及miR-148b-3p表达水平均明显低于中度组和轻度组，差异均有统计学意义(P＜0.01)；且中度组血清miR-150-5p及miR-148b-3p表达水平均明显低于轻度组，差异均有统计学意义(P < 0.01)。见表 3。

2.4 miR-150-5p及miR-148b-3p对老年AIS诊断的价值

血清miR-150-5p及miR-148b-3p表达水平诊断老年AIS的最佳临界值分别为2.82、1.46。两项联合诊断老年AIS的AUC(95%CI)为0.927(0.868~0.991)明显高于单项miR-150-5p[0.837(0.780~0.893)]及miR-148b-3p[0.816(0.758~0.874)]，差异有统计学意义(Z=4.974、5.210，P＜0.05)，其敏感度和特异度为93.0%和86.5%。见表 4和图 1。

2.5 多因素logistic回归分析影响老年AIS的危险因素

以AIS为因变量，年龄、体质指数、收缩压、舒张压、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、miR-150-5p及miR-148b-3p为自变量，进行多因素logistic回归分析，结果显示miR-150-5p及miR-148b-3p低表达是老年AIS发生的独立危险因素，其OR(95%CI)值分别为3.107(2.194~6.715)、2.602(1.713~4.350)。见表 5。

3 讨论

miRNA是一类长度为18~25个核苷酸组成的内源性单链非编码RNA分子，通过影响靶基因的表达，参与AIS中一系列复杂的病理生理过程启动，并促进了AIS的进程^[7-8]。研究表明，miRNA参与降解细胞外基质、调控斑块内细胞凋亡、调节血管内皮功能与血管重塑以及影响动脉粥样硬化斑块的形成和破裂，并且在神经元破坏、修复及病灶局部炎症反应过程发挥重要作用，为AIS的治疗提供了新的靶点^[9-10]。Xu等^[11]研究发现，AIS中差异表达的miRNA可能参与炎症介质的释放及内皮细胞功能紊乱，促进动脉粥样硬化斑块的形成及破裂，影响卒中的发生。亦有研究认为，miRNA可通过碱基互补配对方式识别靶基因3’非编码区降解靶信使RNA或阻遏靶信使RNA的翻译，参与调控AIS的病理生理过程，如动脉粥样硬化、脑水肿和脑缺血再灌注损伤^[12]。

本研究显示，AIS组血清miR-150-5p及miR-148b-3p表达水平明显低于对照组，提示miR-150-5p及miR-148b-3p表达水平降低可能参与AIS的发生发展。本研究中预后不良组血清miR-150-5p及miR-148b-3p表达水平明显低于预后良好组，而且不同神经功能缺损患者血清miR-150-5p及miR-148b-3p表达水平存在差异，神经功能缺损越严重，miR-150-5p及miR-148b-3p表达水平下调越明显。提示血清miR-150-5p及miR-148b-3p表达水平下调与AIS神经功能缺损的严重程度相关，有望成为判断老年AIS患者病情严重程度的生物学标志物。Gacoń等^[13]研究表明，miRNA是基因表达的重要调节因子，与AIS的发生发展密切相关，对临床预测、诊断及治疗AIS具有重要意义。Wu等^[14]研究发现，miRNA表达与脑卒中患者神经功能缺损严重程度有关，可作为评估AIS神经缺陷严重性的生物学指标。本研究进一步应用ROC曲线分析，结果显示血清miR-150-5p及miR-148b-3p表达水平诊断老年AIS的最佳临界值分别为2.82、1.46，两项联合诊断老年AIS的曲线下面积最大，其敏感度和特异度相对较高，有助于提高老年AIS诊断的准确性。Wang等^[15]研究表明，部分miRNA在AIS患者中存在差异表达，这些miRNA在诊断AIS中具有重要的价值，可作为AIS诊断的非侵入性生物学标志物，并可为AIS治疗提供新的靶点。此外，本研究还发现miR-150-5p及miR-148b-3p低表达是老年AIS发生的独立危险因素。易朝晖等^[16]研究也发现，缺血性脑卒中患者miR-150-5p表达水平显著低于对照者，且miR-150-5p低表达与缺血性脑卒中发生具有显著关联，有望作为诊断缺血性脑卒中的生物学标志物。

综上所述，血清miR-150-5p及miR-148b-3p水平在老年AIS患者中呈低表达，是老年AIS发生的独立危险因素，且与神经功能缺损的严重程度相关，两项联合诊断老年AIS的价值较高，有望作为老年AIS诊断的生物学标志物，并可能为老年AIS的临床治疗提供新的思路和依据。但本研究为单中心研究，病例来源较单一，缺乏多中心的研究结果，未来仍需大规模多中心的前瞻性研究来进一步证实miR-150-5p及miR-148b-3p在老年AIS患者中的临床应用价值。