腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth, CMT)是具有高度的临床和遗传异质性的周围神经病变之一，最早于1886年首先报道，发病率1/2500^[1]。而其中CMT1A型是由于PMP22重复突变导致过度编码蛋白，从临床表现方面，主要表现为进行性肢体远端无力、双下肢肌肉萎缩、手脚畸形、远端肢体感觉障碍。从遗传学方面，CMT常见遗传方式为常染色体显性遗传，少数是常染色体隐性遗传、X-性连锁显性遗传以及X-性连锁隐性遗传^[2]。既往研究中报道超过70个基因与CMT疾病相关^[3]。本研究为在我院收集一家系患者相关资料，并用PCR-双酶切方法(Polymerase Chain Reaction-double enzyme digestion)及多重连接依赖的探针扩增技术(multiples ligation dependent probe amplificantion, MLPA)检测等不同的基因检测方法确诊为CMT1A家系。

1 研究对象及方法 1.1 研究对象

该家系共4代共5例发病者，均来自郑州，并同时收集60例性别、年龄与该家系无明显差异的健康人作为对照。所有研究对象的纳入标准参考Dyck1993^[4]。其家系图见图 1。

1.2 收集标本

收集该家系8名成员(因客观因素只收集到该家系的8名成员，其中包括5例发病者)和60名对照组成员的外周血液标本各5 mL。

1.3 PCR-双酶切法

引物由生工生物工程股份有限公司合成。引物设计原理见[Kon-Ping Lin2006]^[5]。引物名称分别是F1、R1、F2、R2；序列分别为5′-TTGGATTCAAAGATATTAGTGTTAT-3′；5′-TAGTAGAGCTCACTCTACAG-3′；5′-TTGGATTCACAGAGACATTAGTTAC-3′；5′-TAGTAGAGTGAGTACAGTGGAC-3。

取血液标本5 ml，运用血液基因组DNA提取试剂盒提取DNA。50 μL PCR反应体系中分别加入DNA 5 μL，dNTPs 5 μL，2XGC BufferI 25 μL，TaqDNA多聚酶0.5 μL，F1和R2各2.5 μL，加灭菌水至50 μL。循环参数：94℃变性30 s，57℃退火60 s，30个循环后72℃延伸5 min。取PCR产物10 μL，分别加buffer3.1 2.5 μL，EcoR I 0.5 μL，Nsi I 1 μL，灭菌水6 μL，37 ℃水浴酶切过夜，80℃失活3 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳，同时参照2 000 bp Marker相对分子质量标准，1 760 bp条带为特异性酶切片段，有此片段可诊断为PMP22基因重复。

1.4 多重连接依赖探针扩增法 1.4.1 变性、杂交 1.4.2 连接

上下游杂交探针彼此相邻，由热稳定的连接酶连接。

1.4.3 PCR

所有连接产物均由同一对引物进行PCR扩增。

1.4.4 毛细管电泳分析扩增产物

通过与对照DNA标本比较相同片段长度峰高的不同来确定目标序列的对拷贝数变化。

2 结果 2.1 临床资料

患者Ⅱ9(先证者)现52岁，自幼有弓形足，平素易疲劳，30岁时逐渐出现行走不稳，呈跨阈步态；双下肢自觉无力，表现为上楼梯需扶扶手。患者Ⅱ3现62岁，自幼有弓形足，40岁出现行走不稳，逐渐加重，现已无法行走。

患者Ⅱ11和Ⅲ7自幼体育较差，且有弓形足，上下楼梯时呈跨阈步态。患者Ⅰ1自幼有弓形足，现已故，死因不详。

体格检查：所有患者均有弓形足，双下肢腱反射消失或减弱，双上肢腱反射对称存在，均无感觉障碍、无肌肉萎缩、无自主神经功能障碍。

2.2 肌肉病理活检结果

该家系中先证者的腓肠肌病理活检结果提示神经源性肌病(图 2)。而该家系中其余成员因经济原因未同意进行此检查。

2.3 遗传分子学结果

该家系8名成员运用PCR-双酶切法检测出5名成员有PMP22基因的重复突变(即1 760 bp片段)(图 3)，其中出现临床症状的有4名成员(Ⅱ3、Ⅱ9、Ⅱ11、Ⅲ7)，其基因携带者有1名(Ⅲ5)。该家系8名成员运用MLPA方法筛查出5名成员(Ⅱ3、Ⅱ9、Ⅱ11、Ⅲ5、Ⅲ7)PMP22基因区域发生基因拷贝数增加，存在重复突变序列(图 4)。运用PCR-双酶切方法及MLPA方法检测该家系基因突变结果是一致的。

2.4 神经电生理检查结果

该家系中4例患者(Ⅱ3、Ⅱ9、Ⅱ11、Ⅲ7)双侧正中神经运动神经传导速度平均19 m/s，均 < 38 m/s，感觉神经传导速度均无波形；双胫后神经、腓总神经运动传导潜伏时延长、速度明显减慢、波幅低，双腓肠神经感觉传导未引出；右胫后神经F波、双下肢H反射未引出；双胫前肌、腓肠肌内头、股直肌肌电图静息期未见异常自发电位，胫前肌MUAP时限宽，主动收缩募集减少，股直肌MUAP时限正常，主动收缩募集正常。1例基因携带者(Ⅲ5)双侧正中神经运动神经传导速度25 m/s、感觉神经传导速度均无波形。60例对照组成员神经传导和肌电图均未见明显异常。

3 讨论

CMT是一组常见的具有临床和遗传异质性的周围神经遗传病，大多数在儿童期或青春期发病，少数发病在成年后^[6]。该家系中所有患病者均在儿童期开始发病，表现为出现弓形足畸形，这符合既往文献报道内容。CMT病程通常在20~30年，甚至更长周期，且下肢症状较上肢症状出现得早、程度更严重^[7]。主要临床表现为进行性、对称性肢体远端无力和肌肉萎缩，而该家系患者主要表现双下肢无力，行走不稳，呈“跨阈步态”，伴弓形足畸形，均未见明显的肌肉萎缩(如未见典型”鹤腿”、“香槟腿”)，这与国内外文献报道有一定差异，这可能是CMT相对少见的临床表现型，在临床上应重视，有必要时进行基因筛查，从而明确诊断^[8]。该家系患者今后是否出现“鹤腿”或“香槟腿”，还需我们长期随访。

初步根据先证者临床表现、肌肉神经病理检查结果及电生理特点考虑为CMT1型，故运用PCR-双酶切及MLPA方法检测PMP22基因重复突变情况，结果发现先证者PMP22基因存在重复突变。同时对该家系中其余7名成员运用上述两种基因检测法进行该基因筛查，检测出余4名成员存在PMP22基因重复突变序列，其中1名为携带者，余3名成员及60名健康人均未发现异常重复突变序列。上述两种基因检测方法检测基因突变结果是一致，但相比较MLPA方法更具有优势：操作简便、灵敏度高、特异性好、精确度高、重复性强，而传统的PCR-双酶切法实验操作时易受DNA标本浓度、引物浓度、PCR条件及酶切温度等影响，故在临床中条件具备者尽量选择MLPA方法筛查CMT1型的PMP22基因重复突变情况。