帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一种常见的神经变性疾病，其主要的病理改变是中脑黑质多巴胺能神经元的变性丢失^[1]。基因突变、环境毒素的接触、线粒体功能障碍和氧化应激等因素共同参与了PD的发病，但是多巴胺能神经元凋亡的具体机制至今未完全阐明。

p53是一种重要的转录因子，因其在细胞凋亡中的重要作用备受关注。p53蛋白含有多个保守的结构域，能够被多种转录后修饰机制所调控，如磷酸化、泛素化和类泛素化、硝基化、甲基化和乙酰化等，其中p53蛋白的乙酰化修饰是介导其转录激活的重要机制之一^[2]。沉默信息调节因子1(silent information regulation 1, SIRT1)是一种NAD+依赖的去乙酰化酶，通过直接靶向去乙酰化组蛋白或其他转录因子如p53而被认为是一种可能的保护因子^{[3, 4]}。本实验在动物活体水平探讨SIRT1与p53在1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氢吡啶(MPTP)小鼠模型中的变化，为阐明SIRT1/p53信号通路参与PD的发病机制提供实验依据。

1 材料与方法 1.1 实验动物

雄性C57BL/6小鼠20只，10~12周龄，体重24~28 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供(生产许可证编号：SCXK(沪)2012-0002)。小鼠每笼4~5只，自由进食和饮水，室温20~25℃，相对湿度40%~50%，12 h昼夜节律，饲养于上海交通大学实验动物中心(使用许可证编号：SYXK(沪)2013-0052)。

1.2 实验动物分组与给药

雄性C57BL/6小鼠适应1周后，进行行为学训练1周，随机分为对照组和MPTP组，每组各10只。MPTP组小鼠腹腔注射MPTP(30 mg/kg，Sigma，USA)，对照组腹腔注射等量生理盐水，连续注射5 d。最后一次给药后第21天处死小鼠，取材，进行后续实验。

1.3 行为学实验

在首次给药前1天、及末次给药后第1、7、14、21天分别进行行为学测试。爬杆实验(pole test)的装置^[5]是长60 cm，直径约1 cm，上端覆以直径约2.5 cm的球形突起。实验时将小鼠头朝上置于球形突起，记录其自放置于杆顶到头转向下的时间(T-turn)和自放置杆顶至爬至杆底后肢着地的总时间(T-total)。每只小鼠测试3次取平均值，每次测试间隔10 min以上。

1.4 小鼠心脏灌注及取材

末次行为学检测结束后，一部分小鼠经心脏灌注取全脑用于组织免疫荧光检测。按40 mg/kg腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，之后心脏灌注操作，断头，小心剥离全脑，置于4%多聚甲醛(paraformaldehyde, PFA)中进行后固定24 h，然后依次浸于20%和30%蔗糖溶液中脱水，至脑组织下沉至瓶底。脑组织经OCT包埋后在冰冻切片机上进行冠状切片，脑片厚度为20 μm。脑片储存于脑片防冻液中，-20℃保存进行免疫荧光及TUNEL检测。另一部分小鼠经颈椎脱臼处死、断头取脑，冰上迅速分离纹状体和黑质，保存于液氮进行高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)及Western blot检测相关蛋白表达。

1.5 高效液相色谱检测神经递质

取剥离纹状体称重，按10 μl/mg加入含有10 mM依地酸钠钙(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)中。冰上避光静置15 min，超声破碎组织。以4℃，15 000 rpm，离心10 min，取上清，记录样品上清量。上清中加入等体积含10 mM EDTA的0.4 M的冷冻HCLO4混匀。冰上避光静置15 min后，以4℃，15 000 rpm，离心15 min，取中间层进行HPLC检测，检测DA及其代谢产物。

1.6 免疫荧光检测黑质区TH阳性神经元及SIRT1表达

参照小鼠脑图谱每一个标本取3片相同部位脑片，采用免疫荧光检测黑质区酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)阳性神经元及SIRT1表达。主要流程如下：洗去脑片防冻液→冰冻切片抗原修复液室温修复5 min→洗去抗原修复液→10%山羊血清封闭1 h→一抗孵育：加TH及SIRT1抗体，4℃过夜→洗去多余一抗→二抗孵育(避光)：加抗鼠荧光二抗(Alexa Fluor 594)及抗兔荧光二抗(Alexa Fluor 488)，室温1 h→洗去多余二抗(避光)→含DAPI的抗荧光淬灭封片液封片→避光晾干→使用奥林巴斯BX51荧光显微镜，在放大10倍、20倍视野下观察拍摄。

1.7 黑质细胞凋亡检测

取1.4中制备的各组脑组织切片，根据TUNEL细胞凋亡检测试剂盒操作步骤进行常规脱水、透明和封片。使用奥林巴斯BX51荧光显微镜，在放大10倍、20倍、40倍视野下观察拍摄。

1.8 Western blot检测纹状体区TH、SIRT1、p53、ac-p53、Bcl-2、Bax蛋白的表达

取各组小鼠纹状体组织，称重，按照适当比例分别加入包含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，冰上组织匀浆器破碎30 s，置于冰上摇床裂解30 min，在4℃、16 000 rpm条件下离心30 min，收集上清液。BCA法测定蛋白浓度。各标本取40 μg，上样，使用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，电泳结束后将蛋白转印到PVDF膜上，完成转膜后使用5% BSA液室温封闭1 h，分别加入不同一抗TH(1 :2 000)、SIRT1(1 :1 000)、p53(1 :1 000)、ac-p53(1 :1 000)、Bcl-2(1 :1 000)、β-actin(1 :2 000)、Bax(1 :1 000)，4℃孵育过夜。次日用TBST清洗，再分别加入辣根过氧化物酶标记的抗兔或抗小鼠二抗(1 :5 000)室温孵育1 h，ECL显色照相，结果用Image-J软件分析图像。

1.9 统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。所有数据均用均数±标准差(x±s)表示。行为学数据的比较使用重复测量数据的方差分析；组间比较用单因素方差分析；组内两两比较采用Dunnett’s T3检测或LSD法。P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 MPTP诱导的帕金森病小鼠表现出行为学异常

爬杆试验是常用的评价MPTP模型小鼠运动迟缓的指标。PD患者临床上也常常表现为运动迟缓。我们发现给予MPTP后的各个时间点，MPTP组的转向时间(T-turn)(P < 0. 01)及爬杆总时间(T-total)(P < 0.001)均较对照组小鼠显著延长。见图 1。

2.2 MPTP诱导的帕金森病小鼠纹状体多巴胺及其代谢产物含量下降

我们使用HPLC检测两组小鼠脑纹状体组织多巴胺(DA)、二羟基苯乙酸(DOPAC)及高香草酸(HVA)的含量。我们发现MPTP组DA(P < 0. 01)、DOPAC(P < 0.001)及HVA(P < 0.01)含量与对照组比较均明显减少。见图 2。

2.3 MPTP诱导的小鼠TH阳性神经元丢失与SIRT1蛋白表达下降一致

PD患者主要的病理改变为黑质致密部DA能神经元变性丢失。在本研究中，我们首先利用免疫荧光双标同时染色TH阳性神经元(红色荧光)及SIRT1蛋白(绿色荧光)。我们发现MPTP组小鼠黑质区TH阳性神经元数目减少的同时，SIRT1蛋白表达也明显减少。见图 3。

进一步通过Western blot检测两组小鼠纹状体区TH及SIRT1蛋白表达水平。我们发现，MPTP组小鼠纹状体区TH及SIRT1蛋白表达与对照组比较均明显减少(图 4)。该结果与黑质区免疫荧光双标结果一致。

2.4 MPTP对小鼠黑质细胞凋亡及凋亡相关蛋白的影响

细胞凋亡在PD的发病机制中扮演重要的角色。TUNEL检测结果显示，与对照组相比，MPTP组黑质区凋亡阳性细胞数明显增多(图 5)。细胞凋亡的途径通常包括外部信号途径和内部细胞凋亡途径，其中线粒体介导的细胞内部凋亡通路主要是由DNA损伤后激活的p53蛋白诱导，而p53蛋白的乙酰化修饰是介导其转录激活的重要机制之一。本实验中，我们发现，MPTP组小鼠纹状体区SIRT1蛋白下降的同时，乙酰化的p53蛋白含量较对照组明显升高，同时p53总蛋白的含量也升高(图 6)。因此我们推测，MPTP能通过抑制SIRT1而引起乙酰化的p53蛋白含量的升高，进而促进黑质多巴胺能细胞凋亡。

Bcl-2家族在调控细胞凋亡中具有重要作用，其可分为促进凋亡和抑制凋亡蛋白两类。Bcl-2和Bax是该家族中最主要的抑制凋亡和促进凋亡的蛋白质，细胞内此两种蛋白表达的异常与细胞凋亡的发生密切相关^[6]。我们发现，MPTP组小鼠Bcl-2蛋白质的水平较对照组明显下降，与之相对应的是，MPTP组Bax蛋白质水平较对照组显著升高(图 6)。

3 讨论

PD最主要的病理改变是中脑黑质多巴胺能神经元的变性丢失，且目前的多巴胺替代疗法只能缓解临床症状，未能减少多巴胺能神经元的凋亡，缓解疾病的进展^{[1, 7, 8]}。目前对PD的研究主要是通过神经毒素特异性的损伤中脑黑质多巴胺能神经元，模拟PD的病理改变和临床症状而实现的。MPTP是常用的制备PD动物模型的药物^[9]。与既往研究结果一致^[10]，本研究发现，MPTP小鼠的爬杆总时间及爬杆转向时间均较对照组明显延长，因爬杆实验是常用的评价MPTP模型小鼠运动迟缓的指标，爬杆动作的完成同时需要姿势调整及平衡协调能力的参与，说明本实验中MPTP小鼠行为学上出现运动迟缓及姿势协调障碍。同时，我们利用HPLC对DA及其代谢产物的检测结果及利用免疫荧光对小鼠黑质区TH阳性神经元的检测结果，共同证实本实验中MPTP小鼠能复制出PD的病理及生化改变。总之，本研究利用MPTP亚急性造模方式^[11]，即MPTP按30 mg/kg连续腹腔注射5天，能够产生稳定的PD病理生化及行为学改变，此种造模方法可应用于临床医学生科研和实践教学。

p53是一种常见的转录因子，通过多种信号通路参与了细胞周期、细胞代谢和自噬、细胞凋亡等过程的调节，尤其在细胞凋亡中的作用备受瞩目。研究发现，鱼藤酮处理PC12细胞后，通过激活p38MAPK诱导p53蛋白向细胞核内的转移进而上调Bax的表达，最终引起线粒体依赖的细胞凋亡^[12]。脂多糖处理PC12细胞后，通过激活p53-caspase3途径诱导细胞凋亡^[13]。神经元接触6-羟基多巴胺后，仅p53蛋白丝氨酸-15位点发生磷酸化的细胞发生死亡，表明p53信号通路的激活可能是6-羟基多巴胺暴露引起细胞凋亡的始动因素^[12]。以上提示，p53蛋白是PD模型多巴胺能神经元死亡的重要中介因子。p53蛋白含有多个保守的结构域，能够被多种转录后修饰机制所调控，如磷酸化、泛素化和类泛素化、硝基化、甲基化和乙酰化等。其中p53蛋白的乙酰化修饰是介导其转录激活的重要机制之一。

SIRT1是一种NAD⁺依赖的去乙酰化酶，通过直接靶向去乙酰化组蛋白或其他转录因子如p53而被认为是一种可能的保护因子。本实验在动物活体水平探讨SIRT1、p53及相关凋亡蛋白在MPTP小鼠中变化，发现MPTP模型小鼠TH阳性神经元凋亡的同时，SIRT1蛋白表达下调，p53蛋白表达及其乙酰化活性上调，促凋亡蛋白Bax表达上调，抑制凋亡蛋白Bcl-2表达下调，提示SIRT1-p53信号通路参与了PD的发病过程，激活或上调SIRT1可能通过调控p53蛋白乙酰化水平，进而抑制p53介导的细胞凋亡。未来研究靶向激活或上调SIRT1相关药物，可能为PD的治疗提供新的思路。