肌萎缩侧索硬化症(ALS)是一种进行性、致死性神经系统变性病，临床表现为进行性加重的肌无力和肌萎缩，部分患者伴随认知功能下降。其进展快、致死率高，50%的ALS患者在起病30个月内死亡，仅20%的患者能存活至起病后5~10年^[1]。根据遗传特点不同，分为遗传性ALS(fALS，占90%~95%)和散发性ALS(sALS，占5%~10%)^[2]。目前已知与ALS有关的主要基因包括：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase 1, SOD1)，约占15%~20%的fALS和1%的sALS；TAR DNA结合蛋白43(TAR DNA-Binding Protein-43, TDP-43)约占4%的fALS和＜1%的sALS；肉瘤融合蛋白(fused in sarcoma, FUS)约占4%的fALS和＜1%的sALS；以及9号染色体开放阅读框72(chromosome 9 open reading frame 72, C9orf72)约占30%~40%的fALS和7%的sALS。

大部分非SOD1和FUS突变的ALS患者皮质、脊髓中存在高度磷酸化、泛素化的并且被裂解成C末端的病理性TDP-43蛋白聚集。TDP-43蛋白聚集也见于非神经元细胞，如星形胶质细胞、小胶质细胞等，并以细胞自主或非自主模式致运动神经元死亡^[3]。TDP-43蛋白异常聚集也被认为与其他神经退行性疾病，如阿尔茨海默病、海马硬化、亨廷顿舞蹈病和路易体病(如帕金森病、路易体痴呆等)有关，这些与TDP-43有关的疾病也被称为TDP-43蛋白病^[4]。

TDP-43蛋白在ALS中的致病机制目前存在两种假设^[5]：①“功能获得”假设：胞浆TDP-43蛋白聚集或TDP-43错义突变通过细胞毒性作用诱发细胞死亡；②“功能缺失”假设：TDP-43在核中定位减少使部分功能缺失。TDP-43在ALS中的具体致病机制仍不十分清楚，因此本文将对此做一综述。

1 TDP-43蛋白的结构和功能概述

TDP-43蛋白由TARDBP基因编码，其位于1号染色体短臂1p36，含有6个外显子^[6]，包含一个N末端、一个C末端和两个RNA识别序列(RNA recognition motifs, RRM)，RRM1和RRM2。N末端包括核定位信号(NLS)、核输出信号(NES)，NLS和NES使TDP-43蛋白在细胞核和细胞浆中运输。RRM1有助于TDP-43与目标RNA的UG重复序列结合，RRM2有助于其与DNA结合和维持蛋白结构。TDP-43蛋白也是一种RNA结合蛋白(RNA binding proteins, RBPs)，其C末端的低复杂序列区域(LCDs)能与RNA结合形成无包膜的RNP颗粒，并参与RNA的加工、转运、储存和降解。

2 TDP-43蛋白在ALS中的致病机制 2.1 TDP-43蛋白稳态与自噬功能密切相关

正常生理状态下，TDP-43蛋白存在于细胞核中，参与RNA的代谢过程，胞核中TDP-43蛋白定位减少，导致TDP-43蛋白功能缺失，影响自噬过程中的不同环节。在Neuro2A、NSC34、NIH3T3等细胞中敲除TDP-43，编码Atg7(自噬主要成分)的mRNA水平下降^[7]，自噬过程受到抑制，泛素化蛋白和自噬/泛素蛋白酶体底物p62积累从而在胞浆中形成包涵体^[8]。下调TDP-43减少Dynactin1蛋白水平^[9]，抑制自噬体﹣溶酶体融合，导致不成熟的自噬囊泡积累，自噬过程受阻，异常聚集的TDP-43蛋白降解减少并在细胞浆中积累，TDP-43蛋白的稳态失衡。在Hela、HEK293、HT22、PC12和SH-SY5Y等细胞中下调TDP-43能够促进转录因子EB(TFEB)的核迁移^[9]。TDP-43蛋白的RRM与RAPTOR mRNA(RAPTOR是mTOR复合体的主要成分之一)结合，敲除TDP-43后RAPTOR的mRNA和蛋白表达水平下降，mTOR途径受抑制^[10]，依赖mTOR的TFEB磷酸化减少，诱导TFEB向细胞核中迁移^{[9, 10]}，TFEB的核定位可增加LAMP1、LAMP2、ATG5、BECLIN-1、CATHEPSINL等自噬相关基因的表达，增强自噬，从而加速胞浆中异常聚集的TDP-43降解。因此，下调TDP-43能影响自噬过程中相关因子的mRNA和基因的表达，进而影响自噬系统。

病理情况下，TDP-43蛋白异常聚集形成包涵体并定位于胞浆中，TDP-43蛋白在胞浆中的异常聚集与自噬系统的功能密切相关。3-MA(3-methyladenine)抑制自噬能促进TDP-43全长及其35 kDa和25 kDa片段的降解产物在N2a和SH-SY5Y细胞中聚集。雷帕霉素处理N2a和SH-SY5Y细胞激活自噬途径，增加异常聚集的TDP-43的降解^[11]。sALS患者脊髓运动神经元中发现与TDP-43蛋白、p62/SQSTM1和泛素共表达的VCP和OPTN。OPTN与泛素结合的位点发生突变后，突变的蛋白无法与myosin VI(MYO6)和Myb1膜转运蛋白靶点(TOM1)相互作用，自噬过程受抑制，蛋白聚集增加。TDP-43A315T突变和过表达TDP-43的SH-SY5Y细胞中LC3和Beclin-1表达增加，TDP-43A315T突变的ALS患者皮肤组织中LC3表达增加，自噬途径激活，并可以此作为ALS的诊断标记物^[12]。

因此，自噬在TDP-43相关的ALS起病和进展中至关重要，TDP-43蛋白稳态的调控与自噬密切有关，其治疗新策略应着眼于研发调节自噬的药物。

2.2 TDP-43蛋白异常分布干扰RNA代谢和应激颗粒的形成

TDP-43蛋白具有剪切调节功能，敲除TDP-43的成年大鼠大脑或人类细胞中数百个剪切位点随之发生改变^[13]。TDP-43蛋白与人CTFR外显子9附近的3’剪切点的TG重复序列结合并且导致外显子跳跃，使mRNA转录、翻译成不同的蛋白，从而影响正常功能。TDP-43与自身TARDBP pre-mRNA的3’非翻译区结合，调节自身表达水平。敲除TDP-43的小鼠ES细胞和人类HeLa细胞以及ALS患者的大脑中能检测到隐秘外显子(cryptic exons)剪切^[14]，在ALS患者的大脑中还检测到参与核输入的RANBP1和参与自噬的ATG4B的隐秘外显子。大部分隐秘外显子能够选择性降解含有翻译提前终止密码子的mRNA，导致无义介导的RNA降解(nonsense-mediated RNA decay)。因此形成一个前馈调节环路，TDP-43功能缺失可能引起TDP-43蛋白在核内定位的减少，而核内TDP-43减少又导致TDP-43蛋白功能的缺失。未来有关TDP-43蛋白的研究重点不应忽略其对相关基因的隐秘外显子剪切作用。

ALS患者神经元中表现出胞浆中TDP-43的积聚，而胞浆TDP-43异常聚集足以致神经元退行性改变，胞浆TDP-43包涵体毒性功能的获得导致疾病发生和进展。ALS患者中，TDP-43蛋白包涵体或磷酸化的TDP-43蛋白与应激颗粒(stress granules, SGs)标记物TIA-1/PABP-1/eIF3共定位。SGs是细胞浆中一种无包膜的RNA颗粒结构，其抑制非重要蛋白翻译而促进应激状态下保护性蛋白质的表达。SGs的形成有助于形成TDP-43蛋白包涵体。抑制ataxin-2(一种SGs组装必需的多聚谷氨酰胺蛋白)表达可减少TDP-43蛋白聚集并减弱其神经毒性作用。在应激状态下TDP-43蛋白有助于SGs的形成和维持，与疾病相关的TDP-43突变增加SGs形成。携带TIA1突变的ALS患者中含TDP-43蛋白的非动力性SGs的积聚增加，呈现出TDP-43包涵体病理改变，TDP-43包涵体并不与TIA1共定位^[15]。在其他携带TDP-43突变的细胞或原代人成纤维细胞中却发现SGs形成保持不变或并未减少^[16]。尽管目前对于SGs在胞浆TDP-43聚集中的作用尚不明确，但是TDP-43在应激状态下调控翻译中扮演的角色正受到越来越多的关注。进一步研究胞浆TDP-43包涵体影响SGs动力和其他RNA颗粒途径的作用至关重要。

2.3 TDP-43蛋白聚集与线粒体功能障碍相互影响

TDP-43蛋白聚集于线粒体导致其毒性功能获得并引起细胞死亡。TDP-43M337V转基因老鼠的脑干和脊髓运动神经元胞浆中线粒体聚集，并出现线粒体嵴的消失和空泡化^[17]。TDP-43A315T转基因老鼠中，线粒体最早出现逆行运输缺陷、随后出现线粒体片段化、顺行性运输缺陷、线粒体“葡萄样”异常聚集，以及形态异常(呈“甜甜圈样”或圆形)^[18]。TDP-43蛋白核定位序列信号的丢失或TDP-43基因突变能增加TDP-43定位于线粒体，并抑制由线粒体DNA编码的氧化磷酸化复合物I亚单位的表达，引起线粒体功能障碍。TDP-43蛋白聚集能减少VAPB与PTPIP51的结合并干扰内质网-线粒体的相互作用^[19]，VAPB基因的突变能导致VAPB表达减少和fALS。以上表明，TDP-43蛋白的聚集能使线粒体形态改变和功能障碍，并致神经元细胞死亡。

线粒体相关的基因突变可致ALS，线粒体内膜蛋白CHCHD10的突变被发现与fALS和sALS有关。TDP-43突变的酵母中存在TDP-43蛋白聚集，在糖酵解和有氧呼吸条件下，TDP-43蛋白聚集均具有一定毒性作用，而在有氧呼吸的条件下，TDP-43蛋白聚集的毒性作用更强^[20]。氧化应激能增加细胞模型中TDP-43蛋白的乙酰化，减弱其与RNA结合，并增加其在细胞浆中的磷酸化和聚集。因此，线粒体功能障碍可导致细胞浆中TDP-43蛋白的聚集，有氧呼吸可增强胞浆TDP-43蛋白聚集的毒性作用。胞浆TDP-43蛋白聚集的毒性功能和线粒体功能障碍，二者之间何为始动因素，何为继发改变，需进一步深入研究。

2.4 TDP-43蛋白聚集致细胞骨架和神经肌肉接头异常

TDP-43蛋白聚集能形成包含mRNAs的颗粒以介导mRNA降解、运输和翻译，这些mRNAs主要编码运动神经元存活蛋白(SMN)/脆性X精神迟滞蛋白(FMRP)、神经丝轻链蛋白(NFL)等，并影响细胞骨架结构。过表达TDP-43(野生型或突变型)的脊髓运动神经元均表现为轴突中TDP-43异常聚集，导致轴突生长减少并产生神经毒性作用^[21]。过表达TDP-43的轴突中存在神经丝相关抗的下调及轴突的去束化和截短化，促进运动神经元早期退行性变。运动神经元易早期和选择性出现退行性改变，这与其轴突完整性受损有关。因此，TDP-43蛋白也与人NFL mRNA的3’UTR直接结合来调节NFL表达。在疾病早期脑脊液或血清中磷酸化的神经丝重链(pNFH)和NFL增加5~10倍，由此，pNFH和NFL可作为ALS的生物标记物^{[22, 23]}。

神经肌肉接头的功能障碍在ALS患者中普遍存在，并先于运动神经元退行性改变出现，认为是ALS的早期改变。在动物模型中，TDP-43Q331K突变的ALS小鼠早期出现突触前膜递质量子化释放和微终板电位(MEPP)频率的减少、神经支配模式异常和突触囊泡及相关蛋白质分布异常^[24]。ALS患者中，重复电刺激表现出重复低频递减，也说明了ALS中存在神经肌肉接头功能障碍。神经肌肉接头功能障碍的机制存在两种假说^[25]：①“顺行而下”，皮质运动神经元的高兴奋性为初始因素，跨突触的、谷氨酸能的兴奋性毒性作用介导包括神经肌肉接头障碍在内的下运动神经元损害；②“逆行而上”，下运动神经元损害为初始因素，病变自神经肌肉接头逆行至神经元胞体，上运动神经元损害为继发损害。进一步阐明其发生机制有助于解释ALS临床特征。

2.5 外泌体降解异常TDP-43蛋白聚集并促进其在细胞之间的扩散

分泌型囊泡(外泌体)从细胞中转运并降解异常聚集的TDP-43蛋白。在TDP-43A315T突变转基因老鼠腹腔内注射GW4869使大脑皮质中性鞘磷脂酶2失活并抑制中枢神经系统外泌体分泌^[26]，胞浆TDP-43蛋白异常聚集增加。携带PrpSC的外泌体可引起异常聚集的TDP-43蛋白在细胞之间呈朊蛋白样扩散^[27]，这可能有助于解释ALS患者临床症状及体征从一个区域扩展至另一个区域。因此，未来的研究关注点应注重揭示在疾病进展过程中，胞浆TDP-43蛋白聚集借助外泌体进行降解并通过朊蛋白样扩散机制来影响不同区域的具体机制，揭示ALS患者出现不同区域受累的症状和疾病进展的病理基础。

3 总结

综上所述，TDP-43过表达或突变形成的胞浆错误定位和TDP-43包涵体是ALS等神经退行性疾病的主要病理改变，其在神经退行性疾病中的致病机制尚不十分明确。目前认为自噬蛋白降解系统、RNA代谢异常、线粒体功能障碍、应激颗粒、轴突运输异常、外泌体形成等机制都可能参与TDP-43的致病过程，明确ALS发病机制有助于为该病的治疗提供新的治疗靶点，研发新的药物。