地球自转产生24小时明/暗周期的昼夜节律，公转产生季节变化。生物为了适应光照、温度或食物供应的规律变化，在生理行为上进化内源性昼夜节律，使器官和细胞能够对变化作出有效反应，以预测危险、防止感染。由生物钟产生的昼夜节律存在于大多数细胞中，包括免疫细胞^[1]。多发性硬化(multiple sclerosis, MS)是一种自身免疫性脱髓鞘疾病，主要由IFN-γ(Th1细胞)或IL-17(Th17细胞)为特征的CD4⁺ T细胞介导，导致中枢神经系统(central nervous system, CNS)炎症和脱髓鞘病变，而在实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)模型小鼠(一种MS模型小鼠)中同样也观察到自身抗原特异性的Th1细胞和Th17细胞。目前，普遍认为发生MS的风险是由遗传和环境因素共同决定的^[2]，并且环境对免疫状态的影响更大^[3]。飞行员、轮班工人和频繁国际旅行者等人群中MS的发病率增加，轮班工作破坏昼夜节律并导致免疫系统失调，这些因素与MS具有较高风险相关联^[4]。以上发现促使人们关注昼夜节律与MS疾病活动性之间的关系^[5]。

昼夜节律通过细胞固有生物钟驱动，经众多基因及表达产物调节免疫反应。研究表明，分子时钟参与调控机体免疫应答，包括核心时钟基因脑和肌肉芳烃受体核转位蛋白(brain and muscle aromatic receptor nuclear translocation proteins, BMAL)、ROR、NFIL3、CLOCK、Period基因(PER)等^[6]。基本机制依赖于CLOCK/BMAL1二聚体激活时钟基因PER1和PER2以及隐花色素(cryptochrome, CRY)1和CRY2，以及PER和CRY蛋白对CLOCK/BMAL1活性的负反馈。CLOCK/BMAL1还激活编码核受体的基因，例如调节BMAL1的REV-ERB和ROR因子基因转录。这些反馈回路使得时钟控制的基因及编码的RNA节律表达。大多数组织中存在昼夜节律，特别是受环境影响的器官，如巨噬细胞基因的10%被时钟控制^[7]，淋巴结中淋巴细胞的迁移和发育也有固定的节律^[8]。

生物钟基因主要通过核心振荡器途径对节律产生影响。振荡器主要由3个内嵌反馈环组成，这3个回路构成了昼夜节律分子钟的基础^[6]。生物钟基因在神经组织的免疫反应中产生作用。健康人若被睡眠剥夺或存在生物钟紊乱，血浆IL-6浓度将增加^[9]。IL-6分泌缺陷小鼠不能产生分泌IL-17的T细胞，提示其对EAE发病有抵抗作用，而IL-6和TGF-β共同促进Th17细胞分化，Treg细胞分化相对减少，导致自身免疫失衡^[10]。Yu等^[11]提出昼夜节律可以调节Th17细胞分化，而IL-17、IL-22等主要促炎细胞因子是MS免疫发病机制中的关键因素，Th17细胞介导的炎症以中性粒细胞向中枢神经系统内募集和神经元损伤为特征^[12]。炎性细胞因子具有季节性变化等^[13]提示节律基因可能通过回路对MS的发病机制产生作用。

1 NFIL3基因在MS发病机制上的作用

NFIL3，也称为E4BP4，是在多种免疫细胞中表达的碱性亮氨酸拉链转录因子，并通过各种细胞类型调控免疫功能。NFIL3通过作用于Th17、Th1细胞等影响MS的发病。肠道微生物群通过影响转录因子NFIL3节律，从而调节脂质摄取和储存，有助于解释在轮班工作或国际旅行中肥胖、糖尿病等疾病发生率增加^[14]。NFIL3可协调多个反应通路。REV-ERBα通过与NFIL 3基因位点上的一个序列结合，直接抑制NFIL3的转录。因此，活化的REV-ERBα^-/-CD4 T细胞中NFIL3的表达高于野生型细胞。此外，幼稚型REV-ERBα^-/-CD4 T细胞在Th17极化条件下表现为分化Th17细胞的能力降低，REV-ERBα^-/-小鼠的肠道的Th17频度减少，说明Th17细胞系发育因NFIL 3和REV-ERBα而与生物钟有关。因为主要免疫细胞谱系发育处于昼夜控制下。Yu等^[11]发现，转录因子NFIL3通过直接结合和抑制ROR-γ启动子来抑制与MS发病密切相关的Th17细胞发育。NFIL3通过转录因子REV-ERBα将Th17细胞的发育与昼夜时钟网络连接起来，Th17细胞的数量越多，那么炎性疾病的易感性也随之增加。有研究表明，在SPF环境中饲养的NFIL 3^-/-小鼠中约10%在6~9月龄时出现直肠脱垂和免疫细胞浸润肠道，而相同环境饲养的野生型小鼠则无此现象。NFIL3^-/-小鼠有较高的IL-17和ROR-γ，小肠和结肠中Th17细胞频率均高于野生型小鼠。另外，NFIL3也对Th1细胞产生影响。长期免疫刺激NFIL3^-/-小鼠的Th1细胞、Treg细胞和NK细胞，IL-10的表达减少。Motomura等^[15]研究表明，NFIL3在控制T细胞中IL-10的分泌可塑性方面也具有重要作用，NFIL3^-/-EAE小鼠表现出更高的EAE评分，且NFIL3^-/-EAE小鼠淋巴结T细胞不表达IL-10，但可产生更多的IL-17，因而NFIL3诱导产生IL-10对EAE疾病缓解十分重要。NFIL3缺失也可消除褪黑素对Th17细胞分化的抑制作用，提示褪黑素对Th17细胞分化的抑制作用依赖于NFIL3，从而支持NFIL3与MS活性负相关^[16]。以上研究说明NFIL3可通过调节T细胞的分泌对自身免疫疾病产生影响。

2 髓系细胞分子时钟基因BMAL在MS发病机制上的作用

在髓系细胞中，BMAL1主要作用是抗炎反应和降低T细胞极化。Lavtar等^[17]发现BMAL基因中rs3789327的CC基因型MS的发病风险显著增加。Sutton等^[18]证实缺乏髓系BMAL1基因的小鼠可产生更多致病型IL-17/IFN-γ T细胞，通过向中枢神经系统扩散和渗透IL-1β分泌CD11b-Ly6 C单核细胞，可使EAE疾病病情加重，进而显示BMAL1通过改变炎症因子的表达来影响EAE的病情严重程度，他们同时也观察到ZT6时间段感染的小鼠MS病情更重，这些小鼠的脊髓中脱髓鞘较为严重且有较多的免疫细胞浸润，ZT18时间段感染的小鼠病情相对较轻，而骨髓细胞中缺乏BMAL1这一生物钟基因的小鼠不再表现出感染时间与病情相关的差异，EAE病情的临床进程也相似。Druzd等^[8]在一项分析中也发现T细胞中BMAL1的缺失会影响EAE的病情严重程度。

3 CLOCK基因在MS发病机制上的作用

遗传水平上，CLOCK基因型在某些人群中有患MS的倾向性。因MS患病率随地理纬度而变化，Lavtar等^[17]比较了900名白种人患者和1024名健康人的8个单链标记核苷酸多态性(SNP)的遗传特征，CLOCK基因中rs6811520的CC基因型MS的发病风险显著增加。他们还发现患者和对照组的基因型分布有统计学差异，但该结果只在女性患者中显著，由此推测若存在CLOCK基因遗传变异，则有患MS的风险。Fortier等^[19]研究表明TCR活性在抗原活化时表现出昼夜节律模式，而在CLOCK突变小鼠这种活性效应变得迟钝，同时他们还发现T细胞增殖需要CLOCK基因，突变小鼠T细胞有丝分裂的敏感性下降。

4 CRY基因在MS发病机制上的作用

Narasimamurthy等^[20]在实验中观察到与WT小鼠相比，CRY1^-/-及CRY2^-/-小鼠IL-6、TNF-α的表达明显增加，在CRY1^-/-和CRY2^-/-细胞中NF-κB和PKA的信号被激活，PKA信号活性增加引起S276残基处p65磷酸化增强从而激活NF-κB，而NF-κB信号是哺乳动物炎性反应的主要调节因子和整合因子之一。转录因子p65与NF-κB结合位点相结合，激活其靶基因，最终导致炎性细胞因子表达增加。基于这些数据，推测缺乏CRY蛋白可能会减少对cAMP产生的抑制作用，从而引起cAMP升高，pKa活化增加，最终导致PKA的激活。S276通过磷酸化p65激活NF-κB。这些结果提示，缺乏CRY基因的免疫细胞通过某些固定的环路可增加炎症因子表达，进而提高慢性炎性疾病易感性^[20]。Cao等^[21]的研究也与上文一致，CRY^-/-小鼠B细胞发育节律被改变，导致血清IgG浓度、血清抗核抗体增高，更易于表现出自身免疫疾病，包括系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)和MS。

5 昼夜节律与MS的治疗

在过去的二十年中，免疫调节和免疫抑制治疗被广泛用于治疗MS，主要一线药物包括β干扰素和醋酸格拉替雷等。几种免疫治疗方法已经开发或正在被评估用于减少MS复发、进展和残疾^[22]。大量文献表明，褪黑素与免疫密切相关，被认为是一种可以调节免疫增强和抗炎平衡的缓冲剂^{[23, 24]}。Watad等^[25]认为这种作用是通过调节Th1/TH2细胞的比例，促进Th1细胞因子的释放，从而具有免疫治疗潜力。同时有动物实验表明外源性褪黑素能增强免疫反应^[26]。褪黑素的季节性模式也可影响多种生理过程，包括昼夜节律和免疫反应，Mauricio等^[3]在EAE模型小鼠中使用褪黑素治疗可改善疾病病情，并直接抑制人类和小鼠T细胞的分化，使MS活动性降低。每日注射褪黑素(5 mg/kg)能改善EAE的临床症状，脾脏、淋巴结和中枢神经系统中Th17细胞的频数下降，且IL-17、IFN-γ和IL-17粒细胞﹣巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)CD4 T细胞出现下降，因而，褪黑素可抑制对Th17细胞的应答，改善临床症状。国外研究临床上已有使用褪黑素作为溃疡性结肠炎的辅助治疗以逆转宏观和微观病变减轻炎症过程^[27]，因此对于MS患者而言调节昼夜节律的相关药物治疗值得关注。

6 小结与展望

节律与免疫之间的关系近年来愈加获得关注。根据昼夜节律中核心生物钟基因BMAL、ROR、NFIL3、CLOCK、PER等对神经免疫性疾病的影响，免疫节律可以为临床制定更合理的治疗方案，以加强昼夜功能或时间的治疗靶向策略，从而减轻MS复发及其所致功能障碍。