慢性脑积水多数发生于颅脑外伤、脑出血、颅内炎症及颅脑手术后，发病率在0.41%~2.9%之间^[1]。前期研究发现出血后脑积水(posthemorrhagic hydrocephalus, PHH)发生于出血3周以后，脑实质原发损伤较大时，间质纤维结缔组织将大量增生对缺损组织进行修复，脑积水脑脊液循环通路发生病理改变，包括小胶质细胞的炎症反应及蛛网膜细胞纤维化，造成的脑脊液吸收障碍^[2]。近年研究表明，脑脊液循环通路梗阻、脉络丛过度分泌及蛛网膜颗粒吸收障碍影响脑脊液动力学，促进PHH，同时，脑脊液循环通路末梢纤维化也参与PHH的发生和发展^{[3, 4]}。纤维化(fibrosis)是指由于炎症等多种因素导致器官实质细胞发生坏死，组织内细胞外基质(extracellular matrix, ECM)异常增多和过度沉积的病理过程。ECM的沉积和基质金属蛋白酶活性的增加，是纤维化疾病的共同病理特征。研究表明，PHH发生时同样存在ECM的过度沉积^[5]。为深入研究慢性脑积水发病机制，目前多采用犬、猪及大鼠作为模型动物，通过脑室内注入自体血或高岭土等手段闭塞脑脊液循环或影响脑脊液吸收造模^[6]。通常取模型动物的小胶质细胞做细胞模型，但小胶质细胞模型无法模拟蛛网膜纤维化的情况，因此对于蛛网膜纤维化致蛛网膜下腔循环障碍的机制可能阐述不清^[7]。凝血酶是出血性疾病如脑室出血、蛛网膜下腔出血的常用诱导剂^[8]。本文体外培养大鼠蛛网膜细胞，建立稳定的传代体系。采用凝血酶刺激体外培养的蛛网膜细胞，模拟脑室出血后慢性脑积水大鼠的蛛网膜细胞纤维化的病理生理过程。观察不同浓度凝血酶体外诱导蛛网膜细胞纤维化水平，为后续研究大鼠脑室出血后慢性脑积水病理生理过程提供研究载体，有利于下一步深入研究脑室出血后慢性脑积水的发病机制。

1 材料与方法 1.1 主要试剂

选取健康1~2 d SD大鼠10只购于湖南铠毕实验动物公司，凝血酶购于武汉海特生物，DMEM等常规细胞培养基、胎牛血清(FBS)购于Thermofisher, Col-Ⅰ抗体、Col-Ⅲ抗体购于Santa Cruz公司，TGF-β1抗体、α-SMA抗体、山羊抗小鼠IgG H&L (Alexa Fluor^Ⓡ 647)、山羊抗兔IgG H&L (Alexa Fluor^Ⓡ 488)购自Abcam公司，酶联免疫试剂盒购于武汉博士德，化学发光试剂盒购于中山金桥。

1.2 大鼠蛛网膜细胞的培养

参照Xin等的方法培养大鼠蛛网膜细胞^[9]。取10只1~2 d SD大鼠。常规消毒，组织剪断头处死，钝性剥离头部皮肤，从后囟门沿骨缝剪开颅骨。大脑剥离后显微镜下剥取蛛网膜，PBS冲洗，剪碎后浸入FBS 10分钟，转移至培养瓶中，取0.1 ml培养液，浸没组织块，移入37℃，5%CO₂培养箱孵育，每3d换完全培养液1次，2周后即可见细胞铺满培养瓶底总面积70%左右即可传代。以0.25%胰蛋白酶消化细胞，待细胞大部分脱落后加入完全培养液终止消化，吹打后制成细胞悬液，按需传代使用。

1.3 鉴定大鼠蛛网膜细胞(ICC检测)

通常以CK 8/18及Desmoplakin作为蛛网膜细胞标志物^[10]。铺片培养传代的蛛网膜细胞，当细胞长满盖玻片面积的60%~70%时取出，4%多聚甲醛固定液固定5分钟，PBS冲洗，4℃下BSA封闭FC段受体90分钟，每张盖玻片滴加200 μl一抗:小鼠抗CK 8/18单抗，兔抗Desmoplakin单抗，4℃过夜。PBS冲洗后滴加200 μl二抗:山羊抗小鼠IgG H & L (Alexa FluorⓇ647)，山羊抗兔IgG H & L (Alexa FluorⓇ488)，室温避光1 h，PBS冲洗。荧光显微镜下观察培养细胞CK 8/18及Desmoplakin表达情况以鉴定蛛网膜细胞。

1.4 凝血酶诱导大鼠蛛网膜细胞纤维化

取生长至第3天时的第3代传代细胞加入24孔培养板培养，加入凝血酶并调节至不同浓度(10、50、100 U/ml), 对照组加生理盐水孵育。

1.5 检测实验组及对照组蛛网膜细胞的纤维化指标 1.5.1 qRT-PCR测定

以Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、TGF-β1、α-SMA为蛛网膜细胞纤维化指标，引物序列设计见表 1。

先提取蛛网膜细胞mRNA。向24孔培养板中每孔加Trizol 1 ml，吹打后静置，加入200 μl氯仿，震荡离心后取上层水相，加入500 μl异丙醇，再次离心后弃去上清液，加入1 ml 75%乙醇洗涤，离心去上清液，干燥后加入50 μl DEPC于-80℃保存。依照试剂盒操作步骤构建反应体系反转录合成cDNA，再以cDNA为模板扩增Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、TGF-β1、α-SMA的基因片段，以大鼠β-actin为内参，条件如下:93 ℃预变性30 s; 94℃变性5 s，60℃退火30 s，35个循环; 延伸5 min。

1.5.2 Western Blot检测Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、TGF-β1、α-SMA表达

PCR结果提示50U/ml凝血酶刺激大鼠蛛网膜细胞后细胞纤维化标志物提高差异最明显，因此以生理盐水为对照组，以50 U/ml凝血酶刺激为实验组Western Blot检测Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、TGF-β1、α-SMA表达。以RIPA裂解液滴入24孔培养板，裂解各组细胞。将裂解液12 000 rpm，4℃条件下离心15分钟，收集上层清液。以BCA试剂盒检测并调整各组蛋白浓度，使之一致。取30 μg总蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳分离，转印至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h。将兔抗Col-Ⅰ抗体(1:1 000)、兔抗Col-Ⅲ抗体(1:1 000)、兔抗TGF-β1抗体(1:600)、兔抗α-SMA抗体(1:1 000)一抗加入封闭液，4 ℃孵育过夜，回收一抗后洗膜3次。加入山羊抗兔二抗(1:2 000)，继续孵育1小时，再次洗膜后用化学发光试剂盒显影。扫描蛋白条带后采用Quantity One软件分析。

1.6 统计学方法

应用SPSS 24统计软件，计量资料以x±s表示，采用方差分析及t检验。P＜0.05为有统计学差异。

2 结果 2.1 大鼠蛛网膜细胞的培养

体外培养的大鼠蛛网膜细胞形状为多极形，胞核大，体积较大，细胞间紧密连接，折光性较好。培养至20日左右细胞生长速度减慢，表现出接触抑制。

2.2 大鼠蛛网膜细胞鉴定

ICC可见95%以上细胞CK 8/18表达阳性，丝状分布于胞浆内，胞核未见表达。95%以上细胞Desmoplakin表达阳性，丝状分布于胞浆内，胞核未见表达(图 1)。

2.3 两组细胞的纤维化指标比较

采用10、50、100 U/ml凝血酶刺激大鼠蛛网膜细胞120 h后，Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、TGF-β1、α-SMA的mRNA相对表达水平与生理盐水对照组相比均有升高，50 U/ml凝血酶刺激升高幅度更大，提示50 U/ml凝血酶刺激效果较好(图 2)。

Western Blot结果:50 U/ml凝血酶刺激后，Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、TGF-β1、α-SMA蛋白表达均有所上调，大鼠蛛网膜细胞纤维化明显(图 3)。

3 讨论

蛛网膜介于硬脑膜与软脑膜之间，是一层不含血管及神经的半透明纤维薄膜。蛛网膜内外表面附着有扁平的间皮，间皮细胞在应激时可脱落游走成为巨噬细胞。蛛网膜向下以蛛网膜小梁附着于软脑膜表面，这些小梁使蛛网膜下隙呈网眼状，脑脊液容纳于蛛网膜与软脑膜间的蛛网膜下隙，使蛛网膜不至于贴附于脑表面。蛛网膜疏松的包裹脑部，在脑底或巨大沟裂附近的蛛网膜往往增厚，可容纳更多的脑脊液，形成脑池。蛛网膜在硬膜静脉窦附近形成很多突入硬膜窦的绒毛样突起，即蛛网膜颗粒，脑脊液经此吸收入静脉窦。健康的蛛网膜容纳并维持脑脊液循环，为脑组织提供缓冲。

离体大鼠蛛网膜细胞的结构与功能均与人蛛网膜细胞类似，已有成熟的永生化大鼠蛛网膜细胞株，由于人蛛网膜细胞的培养仍存在多次传代后细胞衰退的弊端，我们将以大鼠蛛网膜细胞为实验对象。CK8/18及Desmoplakin作为上皮细胞特有的标志物，可用来标记蛛网膜细胞，同时，我们以Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、TGF-β1、α-SMA评估蛛网膜细胞纤维化水平。

有文献认为在小剂量凝血酶(0.1、10、50 U/ml)刺激下，小胶质细胞纤维化水平与凝血酶浓度正相关，呈浓度依赖性。我们的实验证明，当凝血酶浓度进一步增大时，蛛网膜细胞纤维化水平反而可能降低。这可能是由于小胶质细胞与蛛网膜细胞间存在差异，也可能是由于凝血酶浓度继续增大时，影响了蛛网膜细胞的生长，降低了其纤维化水平。

PHH的发生主要由脑室出血引起，脑室出血过程中的血管内皮受损和组织因子释放，能够激活各种凝血因子，使血液呈高凝状态或和形成血栓。其中，凝血酶是参与此过程的重要凝血因子之一。研究表明，凝血酶在PHH的发生和发展中具有促进的作用，利用凝血酶直接注入大鼠脑室可以成功诱导PHH模型^{[11, 12]}。除发挥凝血功能外，凝血酶在细胞纤维化病理过程中发挥重要的作用^[13]。例如在肝脏星状细胞中，凝血酶与蛋白激活受体1(PAR-1)结合，激活下游信号通路，使细胞产生纤维化的表型^[14]。此外凝血酶还可以促进肝脏内纤维蛋白凝块的形成，并催化可溶性纤维蛋白原转化为纤维蛋白单体，从而加剧肝脏的纤维化^[15]。然而，对出血后脑积水的研究主要集中于脑脊液循环通路梗阻、脉络丛过度分泌及蛛网膜颗粒吸收障碍对脑脊液动力学的影响。多种动物模型均已证实出血后脑积水中存在蛛网膜病理性纤维化的现象，提示蛛网膜纤维化可能在脑积水进展过程中发挥一定的作用。目前尚缺乏合适的蛛网膜纤维化细胞模型进行进一步研究。凝血酶诱导脑积水的具体机制尚不清楚，凝血酶导致蛛网膜纤维化是否参与PHH过程尚无研究。转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)活化可能参与了凝血酶诱导的蛛网膜纤维化。TGF-β1是已知的可导致纤维化的重要因子。TGF-β1最初是从血小板中分离的一种细胞因子，正常情况下基本不表达，在某些病理情况下，其表达量成倍增加并释放至CSF，发挥其致纤维化作用^[16-17]。研究发现，将TGF-β1注入大鼠颅内可诱导大量的胶原纤维沉积在柔脑膜的细胞间隙和蛛网膜凸面，沿脑干周围形成脑膜纤维化^[18]。另外，TGF-β1在出血性脑积水较非出血性脑积水中的表达水平更高^[19-20]。SAH及IVH时，脑脊液中凝血酶水平与出血程度、病情进展密切相关^[21]。

前期通过凝血酶脑室注射建立大鼠脑积水模型时注意到转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)在脑积水大鼠中均有不同程度增高，研究发现凝血酶在激活其受体PAR-1后可以诱导TGF-β1活化从而激活TGF-β1信号通路^[22]。实验证实经3种剂量的凝血酶分别刺激离体蛛网膜细胞5日后，TGF-β1与Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA等纤维化指标同步升高，提示TGF-β1可能参与凝血酶刺激蛛网膜细胞纤维化过程，从而参与PHH的发生。

采用离体大鼠蛛网膜细胞进行培养，可以培养出稳定的蛛网膜细胞，经凝血酶刺激后，可诱导蛛网膜细胞成纤维化，为研究蛛网膜纤维化致循环障碍致脑积水的机制研究提供了良好的载体。至于TGF-β1通路在这一过程中是否活化，仍需要更深入的研究。