目前国际卒中学术界已经逐渐接受了早期脑损伤(Early brain injury, EBI)是蛛网膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage, SAH)致死致残的主要原因^{[1, 2]}。SAH后早期脑损伤是一个包含炎性反应、细胞凋亡、血脑屏障破坏、脑缺血和氧自由基损害等众多机制的复杂病理、生理过程，其中氧化应激EBI发展过程中起到关键作用。在基础研究中，大量证据表明应用抗氧化剂如氢气、褪黑素、人重组红细胞生成素等都能够显著减轻SAH后EBI，并改善功能预后^{[3, 4]}。

近年来研究发现，虾青素(Astaxanthin，ATX)是一种具有巨大潜力的保护药物，甚至被认为是迄今为止最强的抗氧化剂，ATX是一种酮式类胡萝卜素，其广泛存在于海洋生物、藻类、真菌及少数植物中，动物与人类自身无法合成。有研究结果显示虾青素能够减轻心脑血管疾病的氧化损伤，缩小梗死范围，改善灌注，且无明显不良反应^{[5, 6]}。但虾青素在蛛网膜下腔出血后的抗氧化应激作用方面的研究报道较少，我们通过建立小鼠的蛛网膜下腔出血模型，早期给予虾青素干预治疗，探讨其在SAH的EBI的神经保护作用及其抗氧化应激机制。

1 材料与方法 1.1 实验动物及分组

本实验研究包括手术和实验动物的使用均符合江苏大学实验动物管理条件，并取得江苏大学附属人民医院动物实验伦理委员会批准。健康成年的SPF级ICR雄性小鼠，体重在28~32 g，采购于江苏大学动物研究中心。小鼠采用随机数字法随机分为四组：蛛网膜下腔出血组(SAH)、假手术组(Sham)、蛛网膜下腔出血组+溶剂组(SAH+Vehicle)、蛛网膜下腔出血组+虾青素组(SAH+ATX)。其中虾青素(ATX)购自sigma公司(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO)，ATX(50mg/kg，稀释溶于DMSO)于蛛血造模前30分钟开始腹腔注射^[7]。

1.2 方法 1.2.1 蛛网膜下出血模型制备及获取标本

采用Sabri及李桃等的小鼠视交叉注血方法建立蛛网膜下腔出血模型^{[8, 9]}, 术后1、24小时，小鼠经水合氯醛5 ml/kg腹腔注射麻醉，固定于木板上，开胸并迅速向左心室置入输液针，剪开右心耳，用输液器灌注生理盐水，待右心房流出液为清亮及肝脏、肺脏颜色发白后停止灌注。后迅速断头取脑，小心剥离出脑组织，选取大脑半球为标本并迅速置于液氮中保存备用。

1.2.2 western

blot检测在盐水灌注后迅速取出大鼠的脑样品，并在0.9%生理盐水(4℃)中冲洗以洗去血液和血液凝块。然后将组织在液氮中冷冻用于分子生物学实验。实验时将冷冻样品在20mM Tris(pH 7.6)中匀浆，提取总蛋白，蛋白定量，转膜，脱脂，加入兔抗鼠NOX2一抗(abcom公司，英国，ab80508，1 : 500)，在4℃过夜，次日TBST洗脱，加入羊抗兔二抗IgG(abcom，英国，ab205718，1 : 5 000)，孵育1 h后，TBST洗脱，化学发光法显色，凝胶成像系统(Bio-Rad公司，美国)进行图像分析，应用β肌动蛋白(β-Actin)作为内参。

1.2.3 TUNEL检测

根据制造商的说明，使用原位细胞凋亡检测试剂盒(Roche，瑞士，11684809910)通过TUNEL染色检测神经细胞的凋亡。将脑组织切片，脱蜡，水合并用柠檬酸-柠檬酸钠溶液修复10分钟。制备TUNEL反应溶液(酶溶液：标记溶液=1 : 9)用于TUNEL检测。将每个切片与50μlTUNEL反应溶液在37℃温育60分钟，并在室温下用山羊血清封闭30分钟。将切片在4℃下与针对神经元细胞核抗原(NeuN)的一抗孵育过夜。接着，加入二抗在室温下孵育切片1小时，在加入荧光猝灭剂之前对核复染剂进行DAPI染色，最后在高倍放大光学显微镜下观察细胞凋亡。

1.2.4 脑水肿检测

在神经评分试验后，通过腹膜内注射戊巴比妥钠(200mg / kg)处死各组大鼠取出脑组织，滤纸吸尽表面血渍，并置于早已烤干并称量的锡纸上，电子天平称取重量(湿重)。然后置标本于80℃烘箱中烘干72小时并再次称重(干重)。脑水含量通过使用下式表示为百分比：[(湿重-干重)/湿重]×100%。

1.2.5 神经功能严重程度评分

参照Garcia、陈平帆等^{[10, 11]}评分方法，总分最高18分，最低3分，包括自发运动、运动对称性、提尾时双前肢对称性、攀爬能力、触须反应、惊吓反应等六方面。每个测试项目依据小鼠能力予以不同的分数(0~3分)。具体标准如下：

1.2.6 ELISA法检测TNF-a/IL-1β水平

采用相应炎症因子ELISA检测试剂盒(南京建成，H052/H002)，按试剂盒说明书检测炎症因子释放量。

1.2.7 统计学分析

实验数据采用均数±标准差表示，用GraphPad Prism 8.0进行数据统计，组间比较采用单因素方差分析和LSD检验，检验数据方差不齐则采用近似F检验Welch法进行比较。以P < 0.05为具有统计学意义。

2 结果 2.1 虾青素抑制蛛网膜下腔出血后NOX2的表达

既往文献已证实在急性脑损伤后小鼠脑组织中NOX2表达呈双峰型^[12]，在SAH后1小时、24小时最高。故本实验利用Western blot法检测ATX对蛛血后NOX2高峰期的作用来说明ATX对机体伤后氧化应激的影响。小鼠造模前腹腔注射ATX(50mg/kg)，取SAH后1小时和24小时大脑皮层提取蛋白标本行Western blot检查。结果显示NOX2在SAH后1小时及24小时后均显著上升(P < 0.01), 注射ATX后，小鼠大脑皮层的NOX2明显下降(P < 0.05)(图 1)。

2.2 虾青素改善蛛网膜下腔出血后的脑水肿

在正常状态下，脑组织中含水量在正常范围内，提示无明显脑水肿。而各组小鼠处理后24 h，SAH组脑组织含水量较假手术组明显增加(P < 0.05)，溶剂组与SAH组之间无统计学差异，但虾青素给药组较SAH组脑组织含水量明显下降(P < 0.05)(图 2)。

2.3 虾青素提高小鼠蛛网膜下腔出血后神经功能评分

应用SAH后24小时的神经功能评分的改变来评估ATX对小鼠神经功能的保护。结果示小鼠处理后24 h，SAH组小鼠活动评分较假手术组显著降低(P < 0.01)，溶剂组与SAH组之间无统计学差异，而虾青素给药组较SAH组的神经功能评分则明显提高(P < 0.05)(图 3)。

2.4 虾青素减少小鼠蛛网膜下腔出血后TNF-a/IL-1β水平

小鼠SAH后24h，SAH组TNF-α和IL-1β的表达较假手术组均明显增加(P < 0.01)，溶剂组与假手术组之间无统计学差异(P>0.05)，而虾青素给药组TNF-α和IL-1β的表达较SAH组明显下降(P < 0.01)(图 4)。

2.5 虾青素减少小鼠蛛网膜下腔出血后的细胞凋亡

小鼠SAH后24 h，TUNEL染色示SAH组阳性细胞较假手术组明显增加，溶剂组与SAH组差别不大，ATX给药组则凋亡细胞明显减少，提示ATX能减少蛛血后引起的神经元细胞大量凋亡(图 5)。

3 讨论

本实验结果显示，蛛网膜下腔出血后NOX2表达明显增加，出血后小鼠的脑水肿加剧，神经功能缺失、炎症因子TNF/IL-1水平升高，同时半球的细胞凋亡细胞明显增多。而伤前30分钟腹腔注射虾青素后能够明显抑制机体的氧化应激、表现为NOX2蛋白表达量明显下降，同时改善机体的脑水肿和神经功能，结果提示NOX2是伤后氧化应激的主要调节因素，虾青素能够抑制氧化应激来发挥神经保护作用。

动脉瘤性蛛网膜下腔出血是一个严重的脑血管疾病，其死亡率高达50%，同时在幸存者中约30%患者遗有不同程度的残疾。大量的研究表明，氧化应激在蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中起着极其重要的作用，蛛网膜下腔出血后的自由基来源于线粒体的呼吸障碍及外源性的血红蛋白，还存在自由基产生酶的上调，例如诱导型一氧化氮合酶(iNOS)，黄嘌呤氧化酶，NADPH氧化酶(NOX)，以及参与花生四烯酸代谢的酶等。越来越多的证据表明NADPH氧化酶(NOX)是中枢神经系统活性氧簇(ROS)的主要来源^{[13, 14]}。有实验证实蛛网膜下腔出血后NOX2mRNA和NOX2蛋白含量明显增加，而当NOX2表达受抑制时，可明显减少大鼠的死亡率及提高大鼠的神经功能^[15]。Zhang团队在大鼠的蛛血标本中发现出血后12小时NOX2蛋白即达到高峰，同时发现在发生蛛网膜下腔出血患者的脑组织标本中神经元细胞及星形细胞中同样有大量的NOX2染色，而运用NOX2蛋白的抑制剂则能明显减少细胞的凋亡及提高大鼠的功能评分^[16]。我们的研究进一步证实了NOX2的活化是蛛网膜下腔出血早期脑损伤的关键因素，而抑制NOX2的活化可以抑制蛛网膜下腔出血的神经功能缺失。

本实验中我们发现蛛网膜下腔出血后，NOX2蛋白明显升高，神经功能受损，同时伴有神经细胞凋亡数明显增加。而应用虾青素能明显减轻NOX2蛋白表达，减轻脑水肿及改善神经功能，这也与国外的类似的研究相一致。Wang等在大鼠的蛛网下腔出血模型中，在出血后3小时鼻饲虾青素(75mg/kg)，出血24小时后观察至虾青素可减轻SAH诱导的脑血管痉挛并减少神经细胞凋亡，同时虾青素能抑制前额叶皮质中线粒体相关的神经元凋亡，增加线粒体的跨膜电位，Bax / Bcl-2比率降低，细胞质中细胞色素C释放受抑制，caspase-3酶活性受到抑制^[17]。而在另一项在对大鼠的蛛网膜下腔出血的研究时，发现伤口大鼠皮层神经元细胞中Nrf2及HO-1增加，而伤后30分钟后侧脑室注射虾青素后大鼠皮层神经元细胞中Nrf2及HO-1进一步明显增加，同时伴有脑水肿的改善及神经功能评分的增加^[18]。在MPP⁺损伤P12细胞的帕金森病的模型中，有关研究观察到MPP⁺损伤后细胞后，细胞内NOX2及HO-1 mRNA及蛋白明显增加，而虾青素+MPP⁺组与对照组及MPP⁺组相比，HO-1明显升高，而NOX2值降低，研究者推测虾青素可能通过HO-1/NOX2轴发挥其抗氧化应激作用^[19]。

本组的研究尚有些不足之处，有待于后期的实验加以改进。首先，我们的研究中每组的实验动物数目偏少(n=5)，这个可能会影响统计学结果，尤其在蛛网膜下腔出血模型的异质性明显时。其次我们的研究比较粗糙，只是仅仅反映了一个虾青素与NOX2两个指标现象的联系，而不是真正揭示了两者的因果关系，未来可能使用NOX2敲基因小鼠或NOX2蛋白直接的抑制剂来揭示这种因果关系，如虾青素在野生型小鼠有神经保护作用，而在NOX2敲基因小鼠丧失了这种保护作用。这些缺陷也指引了我们未来进一步的研究方向。