2019, Vol. 46扩展功能
文章信息
- 冯帆, 王帅, 王亚雨, 赵宗清, 张墨轩, 张健, 衡雪源
- FENG Fan, WANG Shuai, WANG Ya-Yu, ZHAO Zong-Qing, ZHANG Mo-Xuan, ZHANG Jian, HENG Xue-Yuan
- CUX-1在胶质瘤中的表达及其对临床病理和预后的意义
- Expression of CUX-1 in glioma and its significance for the clinicopathological features and prognosis of patients
- 国际神经病学神经外科学杂志, 2019, 46(4): 401-405
- Journal of International Neurology and Neurosurgery, 2019, 46(4): 401-405
-
文章历史
收稿日期: 2019-02-24
修回日期: 2019-07-01
2. 临沂市人民医院神经外科, 山东省临沂市 276000
2. Department of Neurosurgery, Linyi People's Hospital, Linyi, 276000, Shandong. China
胶质瘤，尤其是胶质母细胞瘤，是一种侵袭性极高的中枢神经系统原发恶性肿瘤，目前治疗手段包括最大限度的肿瘤切除辅以放疗及烷化剂化疗[1, 2]。尽管积极给予上述相关治疗，但由于肿瘤的快速增殖，高频复发的特性，目前胶质瘤患者预后极差，平均中位生存期仅为12~15个月[2, 3]。因此找到一种新的分子靶点并在其基础上研究出新的治疗方案，改善患者预后，是目前胶质瘤治疗领域中的重中之重。
转录调节因子CUX-1为同源异型盒(homeobox)家族成员之一，包括3个CUT结构域以及1个CUT同源结构域，富集于大脑皮质上板层，并参与多种疾病的发生及发展。CUX-1的活性和表达主要受caspase样蛋白酶及核组织蛋白酶L介导的蛋白水解过程调节[4]。最近的研究表明，p110 CUX-1(CUX-1的一种亚型)过表达可加速胚胎成纤维细胞的细胞周期向S期转化，从而刺激细胞增殖[5]。在肿瘤增殖方面，大量研究表明CUX-1在乳腺癌，肝细胞癌，导管型胰腺癌以及黑色素瘤中起到明显的促瘤作用[6-8]。近来，一项基因组拷贝分析(genome-wide copy number analysis)证明染色体CUX-1位点(7q22)在胶质母细胞瘤(GBM)细胞中明显扩增，也为本课题提供了理论依据[9]。本研究通过检测CUX-1在胶质瘤组织中的表达，分析其与临床病理特征及患者预后的关系，以探究CUX-1在胶质瘤增殖中的作用，并探讨其作为胶质瘤治疗靶点的可行性。
1 材料和方法 1.1 一般资料收集2015年6月~ 2018年6月期间在临沂市人民医院神经外科接受外科手术切除并经术后病理组织学检查确诊为胶质瘤的66例脑胶质瘤组织标本，以及从颅脑外伤患者额叶减压手术中获取的10例正常脑组织标本，组织获取后立即存于－80℃冰箱保存。性别、年龄、随访和预后等临床数据均从病例记录中获得。本研究获得了所有患者的书面知情同意书及临沂市人民医院伦理委员会的批准。
1.2 Westernblot检测组织匀浆后提取总蛋白, 二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度。常规电泳, 转膜, 封闭后加入CUX-1一抗抗体(1 : 2 000; Proteintech, China), 4℃静置过夜, 洗膜, 加入辣根过氧化物酶标记二抗(1 : 2 500；Cell signaling, USA), PBST洗膜三次, 吸取等量ECL超灵敏型检测试剂盒A液、B液, 均匀滴于PVDF膜上进行化学发光显影, 用Quantity One (version 4.6)分析软件计算CUX-1蛋白的表达水平。
1.3 免疫组织化学检测将胶质瘤组织石蜡包埋，切片(4μm)，70℃烘干45分钟，石蜡切片常规脱蜡水化后，抗原修复，滴加过氧化物酶阻断剂，PBS冲洗，5%正常山羊血清封闭，滴加一抗(CUX-1，1 : 400；Abcam, USA)，4℃孵育过夜后PBS冲洗，滴加二抗，DAB显色，苏木素复染，盐酸分化后水洗，氨水返蓝，梯度酒精脱水，透明，封片。免疫组学分析和评分由2名病理诊断师独立完成，阳性染色以细胞质和/或细胞核中出现棕黄色颗粒为准。最终分数由染色强度(+ ~ + + +)及阳性细胞数(0~100%)综合评定。综合评分标准如下：评分0分(阴性)，评分2分(+ +，< 10%)，评分3分(+，>50)，评分4分(+ +，< 50%)，评分5分(+ +，>50%)，评分6分(+ + + +，100%)。我们将评分≤4分定义为低CUX-1表达组，而评分>4分作为高CUX-1表达组。
1.4 生物信息学分析本研究中，所有数据均来自以下公共数据库网站：癌症基因组图谱(TCGA，https://cancergenome.nih.gov/)；基因型组织表达(GTEx，https://gtexportal.org/)；UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)；STRING(https://stringdb.org/)。利用UALCAN和STRING在线工具从数据库中获得基因差异性分析和Kaplan-Meier生存曲线。
1.5 统计学方法所有统计数据均采用SPSS 19.0及GraphPad Prism 5统计分析软件进行处理。各组间差异比较采用t检验，CUX-1表达水平与各临床病理参数分析采用χ2检验; CUX-1表达情况与胶质瘤患者生存时间的关系用Kaplan-Meier法做生存分析，生存期差异比较采用Log-Rank检验。以P < 0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 CUX-1相关生物信息学分析为了明确CUX-1与肿瘤发生的关系，我们首先利用UALCAN在线工具，通过生物信息学分析，检测CUX-1在胶质瘤中的表达。结果表明，与正常组织相比，胶质瘤组织中CUX-1水平明显升高，提示CUX-1表达增加与肿瘤发生有关(图 1a)。此外，在胶质瘤患者中，低CUX-1表达可显著延长胶质瘤患者的总体生存期(OS)(图 1b，P=0.03)。综上，生物信息学分析表明，较高的CUX1表达水平可能与胶质瘤患者的肿瘤发生及不良预后有关。
|
| a：不同胶质瘤组织中CUX-1的差异表达分析；b：Kaplan-Meier生存曲线(低表达，N＝113；高表达，N＝39，P＝0.03)。上述数据均来自TCGA数据库及GTEX数据库。 图 1 生物信息学分析CUX-1在数据库中的表达及生存分析 |
我们通过Westernblot方法检测了正常脑组织(n=1)及不同级别胶质瘤样本(n=8)中的CUX-1表达情况，结果表明CUX-1的表达随着胶质瘤WHO分级的升高而上调(图 2)。为了进一步验证上述结果，我们对10例正常脑组织样本及66例胶质瘤组织样本(包括WHOⅠ~Ⅳ级)进行了CUX-1免疫组化染色，结果表明CUX-1在高级别胶质瘤(HGG)中的表达显著高于低级别胶质瘤(LGG)，在正常脑组织中CUX-1阳性细胞数最少(图 3a-f)。CUX-1高表达占正常脑组织样本的10.0%(1/10)；占毛细胞性性星形细胞瘤(PA，WHOⅠ)和弥漫性星形细胞瘤(WHOⅡ)样本的39.4%(13/33)；占间变性星形细胞瘤(WHOⅢ)和胶质母细胞瘤(GBM，WHOⅣ)样本的78.8%(26/33)(图 3g，表 1)。
|
| a, b：WHOⅠ~Ⅳ级胶质瘤及非肿瘤标本中CUX-1蛋白的Westernblot分析；*，* *分别表示P < 0.05、P < 0.01。 图 2 CUX-1在胶质瘤组织中高表达 |
|
| a：WHO I~IV级胶质瘤；b-e：及阴性对照；f：无CUX-1抗体的免疫组化图像及分析。(×200)。正常脑组织和胶质瘤标本CUX-1染色的统计分析。 图 3 正常脑组织 |
| 组别 | 例数 | CUX-1表达评分 | ||
| 阴性 | 低表达 | 高表达 | ||
| 正常脑组织 | 10 | 3 | 6 | 1 |
| WHO Ⅰ-Ⅱ级 | 33 | 4 | 16 | 13 |
| WHO Ⅲ-Ⅳ级 | 33 | 1 | 6 | 26 |
根据CUX-1的表达水平，将66例胶质瘤样本分为两组：CUX-1高表达组(n=39)，CUX-1低表达组(n=27)。相关性分析结果表明，高水平的CUX-1与胶质瘤WHO分级(P=0.001)及肿瘤增殖指标Ki67(P=0.002)、P53mut(P=0.002)显著相关，而与患者年龄，性别，肿瘤大小，肿瘤位置，KPS评分之间均无统计学意义(图 4，表 2)。
|
| CUX-1与p53、Ki-67两种临床病理参数的免疫组化分析。(×200)。 图 4 CUX-1表达与临床病理参数的关系 |
| 临床病理参数 | CUX-1表达水平 | ||||
| 例数 | 低表达 | 高表达 | χ2 | P值 | |
| 性别 | |||||
| 男 | 33(50.0) | 16(48.5) | 17(51.5) | ||
| 女 | 33(50.0) | 11(33.3) | 22(66.7) | 0.002 | 0.964 |
| 年龄 | |||||
| < 44 | 42(63.6) | 19(45.2) | 23(54.8) | ||
| ≥44 | 24(36.4) | 8(33.3) | 16(66.7) | 0.895 | 0.344 |
| 肿瘤直径 | |||||
| < 4 cm | 17(25.7) | 7(41.2) | 10(58.8) | ||
| ≥4 cm | 49(74.3) | 20(40.8) | 29(59.2) | 0.001 | 0.975 |
| 肿瘤位置 | |||||
| 额叶 | 39(59.1) | 19(48.7) | 20(51.3) | ||
| 颞叶 | 20(30.3) | 4(20.0) | 16(80.0) | ||
| 其他 | 7(10.6) | 4(57.1) | 3(42.9) | 5.364 | 0.068 |
| KPS评分 | |||||
| < 80 | 34(51.5) | 11(32.4) | 23(66.6) | ||
| ≥80 | 32(48.5) | 16(50.0) | 16(50.0) | 2.124 | 0.145 |
| WHO分级 | |||||
| Ⅰ-Ⅱ | 33(50.0) | 20(60.6) | 13(39.4) | ||
| Ⅲ-Ⅳ | 33(50.0) | 7(21.2) | 26(78.8) | 10.593 | 0.001* |
| P53表达 | |||||
| 野生型 | 42(63.6) | 23(61.9) | 19(38.1) | ||
| 突变型 | 24(36.4) | 4(16.7) | 20(83.3) | 9.169 | 0.002* |
| Ki-67表达 | |||||
| 低表达 | 30(45.5) | 19(63.3) | 11(36.7) | ||
| 高表达 | 36(54.5) | 9(25.0) | 27(75.0) | 9.844 | 0.002* |
此外，我们对66例胶质瘤患者进行了生存分析。根据Kaplan-Meier曲线，CUX-1低表达可显著延长胶质瘤患者的总体生存期(OS)(图 5)。上述结果也与生物信息学分析结果相一致，进一步证明CUX1与胶质瘤的恶性程度及肿瘤增殖密切相关。
|
| (低：n=33；高：n=33) 图 5 低表达及高表达CUX-1的胶质瘤患者的Kaplan-Meier生存曲线 |
CUX1属于同源域转录因子家族，位于染色体7q22位点，主要表达于迁移、增殖的中枢神经系统(CNS)颗粒细胞中[10]。之前已有大量研究证明CUX1在多种肿瘤中可作为侵袭及增殖的生物标志物，包括白血病、乳腺癌、胰腺癌和黑色素瘤等[11]。目前CUX-1在胶质瘤中发挥的功能及作用仍不清楚。近来有研究发现胶质母细胞瘤患者的染色体CUX-1位点出现明显扩增及突变，同时转录因子CUX-1在替莫唑胺(TMZ)诱导的DNA双链损伤(DSBs)中起着重要的修复作用，从而介导胶质瘤的化疗耐药[9]。因此，我们认为CUX-1在胶质瘤的发生及进展过程中发挥了重要的促瘤作用。为了验证上述假说，我们首先在TCGA公共数据库中进行生物信息学分析证明CUX-1在胶质瘤中的表达显著上调，且CUX-1的高表达可明显缩短胶质瘤患者的总体生存期。之后我们通过westernblot及免疫组化实验在组织层面上证明了CUX-1的表达随肿瘤WHO级别的升高而显著上调，同时我们对66例胶质瘤样本的免疫组化结果进行分析，发现CUX-1的表达与肿瘤增殖指标Ki67及突变型P53的水平明显相关，进一步论证了CUX-1在胶质瘤中介导的促瘤作用[12-14]。最后Kaplan-Meier生存曲线也证明CUX-1高表达的胶质瘤患者生存时间明显缩短(P < 0.05)，该结果也与之前的生物信息学分析结果相吻合。
本实验证明了在胶质瘤中CUX-1的表达与肿瘤恶性程度密切相关，同时CUX-1可能在胶质瘤的增殖、侵袭方面发挥重要作用，其中的具体分子作用机制有待于下一步的体内实验进一步证明。综上，转录因子CUX-1在胶质瘤中可作为一个新的分子标志物及治疗靶点，并且有望基于该靶点产生新的胶质瘤治疗方案，从而改善胶质瘤患者的生存预后。
| [1] |
Louis DN, Perry A, Reifenberger G, et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System:a summary[J]. Acta Neuropathol, 2016, 131(6): 803-820. DOI:10.1007/s00401-016-1545-1 |
| [2] |
李欣龙, 陈礼刚. 脑胶质瘤的微环境[J]. 国际神经病学神经外科学杂志, 2018, 45(5): 503-506. |
| [3] |
Ostrom QT, Gittleman H, Xu J, et al. CBTRUS Statistical Report:Primary Brain and Other Central Nervous System Tumors Diagnosed in the United States in 2009-2013[J]. Neuro Oncol, 2016, 18: v1-v75. DOI:10.1093/neuonc/now207 |
| [4] |
Han S, Li Z, Master LM, et al. Exogenous IGFBP-2 promotes proliferation, invasion, and chemoresistance to temozolomide in glioma cells via the integrin beta1-ERK pathway[J]. Br J Cancer, 2014, 111(7): 1400-1409. DOI:10.1038/bjc.2014.435 |
| [5] |
Diodato A, Ruinart de Brimont M, Yim YS, et al. Molecular signatures of neural connectivity in the olfactory cortex[J]. Nat Commun, 2016, 7: 12238. DOI:10.1038/ncomms12238 |
| [6] |
Sansregret L, Gallo D, Santaguida M, et al. Hyperphosphorylation by cyclin B/CDK1 in mitosis resets CUX1 DNA binding clock at each cell cycle[J]. J Biol Chem, 2010, 285(43): 32834-32843. DOI:10.1074/jbc.M110.156406 |
| [7] |
Vadnais C, Shooshtarizadeh P, Rajadurai CV, et al. Autocrine Activation of the Wnt/beta-Catenin Pathway by CUX1 and GLIS1 in Breast Cancers[J]. Biol Open, 2014, 3(10): 937-946. DOI:10.1242/bio.20148193 |
| [8] |
Ripka S, Neesse A, Riedel J, et al. CUX1:target of Akt signalling and mediator of resistance to apoptosis in pancreatic cancer[J]. Gut, 2010, 59: 1101-1110. DOI:10.1136/gut.2009.189720 |
| [9] |
Kojima K, Takata A, Vadnais C, et al. MicroRNA122 is a key regulator of alpha-fetoprotein expression and influences the aggressiveness of hepatocellular carcinoma[J]. Nat Commun, 2011, 2: 338. DOI:10.1038/ncomms1345 |
| [10] |
Kaur S, Ramdzan ZM, Guiot MC, et al. CUX1 stimulates APE1 enzymatic activity and increases the resistance of glioblastoma cells to the mono-alkylating agent temozolomide[J]. Neuro Oncol, 2018, 20(4): 484-493. DOI:10.1093/neuonc/nox178 |
| [11] |
Xu J. Li P. Expression of EAP1 and CUX1 in the hypothalamus of female rats and relationship with KISS1 and GnRH[J]. Endocr J, 2016, 63(8), 681-690.
|
| [12] |
Kuhnemuth B, Muhlberg L, Schipper M, et al. CUX1 modulates polarization of tumor-associated macrophages by antagonizing NF-kappaB signaling[J]. Oncogene, 2015, 34(2): 177-187. DOI:10.1038/onc.2013.530 |
| [13] |
Zakraoui O, Marcinkiewicz C, Aloui Z, et al. Lebein, a snake venom disintegrin, suppresses human colon cancer cells proliferation and tumor-induced angiogenesis through cell cycle arrest, apoptosis induction and inhibition of VEGF expression[J]. Mol Carcinog, 2017, 56(1): 18-35. DOI:10.1002/mc.22470 |
| [14] |
Yuan y, Xiang W, Yanhui L, et al. Ki-67 overexpression in WHO grade ii gliomas is associated with poor postoperative seizure control[J]. Seizure, 2013, 22(10): 877-881. DOI:10.1016/j.seizure.2013.08.004 |