孤独症谱系障碍(autism spectrum disorders, ASD)，又称自闭症，主要表现为社交障碍、刻板重复行为及兴趣范围狭窄等^[1]。有很多学者致力于ASD的病因学研究，但具体机制仍不明确，有研究认为可能与神经元之间的连接、突触功能异常、神经递质异常等有关^[2-4]。

c-Jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase, JNK)又被称为应激活化蛋白激酶(stress activated protein kinase, SAPK)，是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)系统成员之一，参与细胞生长、分化等的调控。有研究显示在帕金森病(Parkinson's disease, PD)动物模型中，JNK介导的ATF-2激活与多巴胺能神经元的凋亡有关^[5]。在阿尔茨海默(Alzheimer’s disease, AD)患者大脑尸检中发现JNK高度表达，活化的JNK与AD的两大标志性病理通路，即tau蛋白介导的神经退行性变及β-淀粉样蛋白(β-amyloidprotein, Aβ)通路密切关联^[6]，此外，JNK的活化与突触损伤密切相关^[7]。JNK是否参与了孤独症的发病，目前尚无相关报道。但有研究显示染色体16p11.2的微缺失或微重复与ASD发病密切相关，占病例总数的1%，该区域基因编码的蛋白TAO可通过激活JNK来调节皮质神经元中的基底树突发育^{[8, 9]}。

本研究拟通过检测ASD患者体内JNK的表达水平，构建JNK腺病毒载体并转染原代神经元细胞，检测JNK信号通路的改变及其对突触蛋白的影响，初步探索JNK信号通路在ASD发病机制中的作用。

1 对象及方法 1.1 研究对象

选择2016年6月至2017年6月于本院确诊并进行康复训练的30例孤独症患儿作为ASD组，同期于本院儿童保健所做健康体检的30例健康儿童作为对照组。

ASD组患儿均符合以下标准^[10]：①美国精神障碍诊断与统计手册第五版(DSM-V)中儿童孤独症的诊断标准；②孤独症行为量表(ABC)诊断标准；③儿童孤独症评定量表(CARS)诊断标准。

排除标准：①患有急慢性感染性疾病、自身免疫疾病、恶性肿瘤；②器官功能严重损伤；③合并癫痫、脑发育畸形等神经系统器质性疾病；④家属拒绝入组。

ASD组：男23例，女7例，平均年龄(3.8±1.9)岁；对照组：男23例，女7例，平均年龄(3.7±2.2)岁。两组患者年龄、性别比较差异无统计学意义，具有可比性。

本研究已经通过湖南省儿童医院伦理委员会伦理审核。

1.2 外周血单核细胞中JNK表达水平检测及疾病严重程度评估

所有研究对象均行空腹静脉采血，用EDTA-K2抗凝管收集外周血5~8 ml，分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)，采用Western Blot方法检测PBMC中总JNK(total JNK, T-JNK)及磷酸化JNK(phosphorylated JNK, p-JNK)表达水平。

疾病严重程度采用儿童期孤独症评定量表(Children Autism Rating Scale, CARS)进行评定，由专业人员进行，评定诊室需安静、避免存在分散患儿注意力的物品。该量表包括15个评定项目，每个项目都按1、2、3、4级标准评分，总分15~60分。总分低于30分则评为非孤独症；总分在30~36之间，并且低于3分的项目不到5项，则评为轻~中度孤独症；总分等于或高于36分，并且至少有5项的评分高于3分，则评为重度孤独症。

采用单因素回归分析评估外周血JNK活化水平与CARS评分相关性。

1.3 JNK腺病毒转染原代神经元细胞

将孕龄17~18 d的B6小鼠脱颈处死后剖腹取出胎鼠置于预冷的高糖DMEM培养液中冲洗3~4遍。在无菌条件下分离出双侧海马并用收集分散的单细胞悬液。接种细胞并置于37℃，5% CO₂培养箱中培养。JNK过表达腺病毒载体及空白对照载体由上海吉凯基因工程公司提供。将状态良好的目的细胞接种到24孔板，使细胞浓度为1×10⁵/ml。分别添加JNK过表达腺体病毒载体和等滴度同体积的空白病毒载体，根据干预措施不同分为JNK过表达组和对照组。加入的病毒量范围在MOI=20~50内，感染24 h后，开始观察到荧光表达，达到最大转染效率时收集细胞并提取蛋白，用Western blot方法检测原代神经元细胞中T-JNK、p-JNK、磷酸化c-Jun(phosphorylated c-Jun, p-c-Jun)、磷酸化ATF-2(phosphorylated ATF-2, p-ATF-2)、囊泡谷氨酸转运体(vesicular glutamate transporter, VGLUT)和囊泡型GABA转运体(vesicle type GABA transporter, VGAT)的表达水平。

1.4 统计学方法

应用SPSS 18.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差( x±s)表示，组间比较采用t检验；采用Pearson相关系数分析p-JNK/T-JNK比值与CARS评分的相关性。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 ASD组与对照组外周血PBMC中JNK及p-JNK表达水平的比较

ASD组和对照组PBMC中T-JNK表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，但ASD组p-JNK表达水平以及p-JNK/T-JNK比值显著高于对照组，差异有统计学意义(P < 0.05)。见表 1及图 1。

2.2 JNK活化水平与疾病严重程度的关系

ASD组及对照组60名患儿均接受CARS量表评定，结果显示ASD组得分为37.85±5.45，其中轻~中度孤独症21例，重度孤独症9例，对照组得分为16.18±2.41，未筛选出孤独症儿童，两组得分有显著差异(P < 0.001)。Pearson相关系数分析外周血p-JNK/总JNK比值与CARS评分相关性，结果提示JNK活化程度与疾病严重程度不具有相关性(r=0.03, P>0.05)。

2.3 JNK过表达对原代神经元细胞中c-Jun、ATF-2表达水平的影响

JNK过表达组及对照组神经元细胞DAPI染色、MAP-2染色如图 2所示，Western blot检测提示JNK过表达组中总JNK、p-JNK、p-c-Jun及p-ATF-2的表达水平均显著高于对照组，差异具有统计学意义(P < 0.05)，见表 2及图 3。

2.4 JNK过表达对原代神经元细胞突触囊泡转运体表达水平的影响

JNK过表达组中VGAT的表达水平均显著低于对照组，差异具有统计学意义(P < 0.05)，JNK过表达组中VGLUT的表达水平与对照组比无明显差异(P>0.05)，见表 3及图 4。

3 讨论

孤独症谱系障碍的病因和发病机制迄今尚未阐明，基因检测发现的几个高风险基因均与突触发育相关，编码的蛋白能影响突触形成、成熟以及突触与神经元的连接，因此有人提出突触功能障碍很可能是孤独症核心症状的病理学假说^[11]。

有研究指出哺乳动物大脑中JNK的活性高于任何其他组织^[12]，表明JNK可能在中枢神经系统中发挥重要作用，能调节大脑的生理和病理过程。本研究采用病例对照研究的方式比较了ASD患者与正常儿童PBMC中JNK的表达水平，发现ASD组p-JNK表达水平以及p-JNK/T-JNK比值均显著高于对照组，提示JNK信号通路在ASD患儿体内活化程度更高，但JNK活化程度高低与CARS评分无显著相关性，提示该通路的异常活化虽然可能参与了ASD的发病，但与ASD核心症状的严重程度不相关。JNK是介导MAPK磷酸化的重要信号通路，也介导了炎症反应和凋亡的过程。有研究显示，ASD患者体内存在炎症因子失衡^[13]，JNK的异常活化与ASD患者炎症失衡之间是否存在关联，仍有待进步一研究。

VGAT及VGLUT是参与GABA能与谷氨酸能神经递质包装的重要囊泡蛋白，在GABA能与谷氨酸能神经递质释放中发挥重要作用。GABA是大脑中最重要的抑制性神经递质，主要由谷氨酸脱羧酶合成。除了作为神经递质的功能外，它还是神经发生及神经修复中重要的营养因子^[14]。本研究利用JNK过表达腺病毒载体转染原代神经元细胞，发现JNK信号通路活化可上调转录因子p-c-Jun及p-ATF-2的表达水平，同时还可引起囊泡转运体表达水平的改变，表现为VGAT表达水平下调，但VGLUT表达水平无明显变化。有研究发现ASD患者血清中GABA表达水平也低于正常对照组^[15]，因此我们推断活化的JNK可能通过影响转录因子的表达，进而影响了抑制性神经递质的水平，但本研究未采用JNK抑制剂进行对照，无法判断JNK下调时是否影响相应蛋白的表达，在后续研究过程中将进一步完善。

综上所述，本研究认为JNK信号通路可能参与了ASD的发病，但与疾病严重程度无关。通过上调JNK表达水平能使转录因子ATF-2和c-Jun活化，下调突触囊泡转运体中VGAT表达，但具体调节机制仍有待进一步研究。