多发性硬化(multiple sclerosis, MS)被广泛认为是一累及中枢神经系统(central nervous system, CNS)白质的自身免疫性脱髓鞘性疾病。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)是公认的研究MS的理想动物模型。CD44是一种黏附性糖蛋白，主要参与细胞-细胞、细胞-基质之间的黏附。目前可见很多自身免疫性疾病中CD44表达增加的报道，如系统性红斑狼疮、银屑病、IgA肾病、溃疡性结肠炎、特发性血小板减少性紫癜等^[1-5]。研究表明^[6]，在MS患者中骨桥蛋白(osteopontin, OPN)表达增高，其主要与CD44结合，促进IL-1、IL- 2、IL-12等的表达，抑制IL-4的表达，从而使免疫格局向Th1偏移，促进MS的发生发展，可见OPN是CD44表达的主要调控者。目前关于CD44分子在EAE中表达情况的研究报道较少。本实验通过制造EAE模型，测定正常对照组及EAE组大鼠脑和脊髓组织中CD44的含量，观察黏附分子CD44在EAE中的表达情况及初步探讨在其发病中的可能作用。

1 材料与方法 1.1 实验动物及试剂

雄性Wister大鼠20只，6~8周龄，体重200~250 g；豚鼠4只，体重400~450 g，以上动物由西南医科大学实验动物科提供。主要实验试剂：氟氏完全佐剂(购自美国Sigma公司)；兔抗大鼠CD44单克隆抗体(购自北京博奥森生物技术有限公司)；中性甲醛固定液由病理教研室提供。

1.2 方法 1.2.1 大鼠分组及EAE模型的建立

20只雄性大鼠随机分为正常对照组和EAE组，每组10只。将豚鼠处死后，在无菌操作下，迅速剥出脊髓，去掉马尾与脊膜，称重。加入生理盐水研磨成50%匀浆，与等量福氏完全佐剂混合，用注射器反复抽打成油包水乳液，即制得粗制碱性髓鞘蛋白(myelin basic protein, MBP)抗原。将MBP抗原注入EAE组大鼠双后肢足垫皮下，每只0.2 ml/100 g。

1.2.2 神经功能评分及评分标准^[7]

于建模后第1天开始(建模当天计为第1天)，每日同一时段由同一人单盲观察发病情况，进行神经功能评分。0分：无明显异常；1分：后肢不完全瘫痪；2分：后肢完全瘫痪；3分：后肢全瘫伴前肢不全瘫；4分：四肢全瘫或死亡。症状介于两条标准之间者以±0.5分计。

1.2.3 试验终止

EAE组连续3 d症状评分无加重或四肢瘫痪、死亡作为EAE发病高峰期，在高峰期处死大鼠；正常对照组4周后处死。

1.2.4 脑和脊髓组织病理观察

脑和脊髓组织标本用中性甲醛固定后，在泸州医学院病理教研室作组织切片，常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋和切片(8 μm厚)。切片后烘干、脱蜡和常规苏木素﹣伊红染色，光镜下观察病理改变。

1.2.5 CD44的测定

采用免疫组织化学法检测脑和脊髓组织CD44的表达；操作严格按SP试剂盒提供的说明书进行。

1.2.6 结果判断

免疫组化结果用美国Nikon Spot图像采集系统进行图像采集，用Image-Pro Plus Versi-on 5.1图像分析系统分析。包浆呈棕黄色至深棕黄色为CD44阳性染色细胞。每张大鼠脑组织切片于光镜下(×400)观察10个视野，计算CD44平均光密度(A)值。

1.3 统计学方法

统计学处理由SPSS 16.0软件完成。所得数据以均数±标准差(x±s)表示，变量间相互关系采用Pearson直线相关分析，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 发病情况

正常对照组大鼠未发病。EAE对照组均有不同程度的发病，发病率100%。发病动物表现为脱毛、食欲减退、体重下降显著，出现不同程度的肢体无力、共济失调、瘫痪等，部分动物伴尿便失禁。EAE组发病潜伏期为(11.6±2.5)d，进展期为(7.2±1.4)d，高峰期症状评分为(3.1±1.1)分。

2.2 病理学检查

将大鼠的脑和脊髓切片经HE染色后，在光镜下观察显示：正常对照组大鼠脑和脊髓未见异常。EAE对照组大鼠发病高峰期可见脑及脊髓实质内小血管充血，脑组织疏松肿胀，血管周围主要是小静脉周围有大量炎性细胞浸润，主要为淋巴细胞及单核细胞，典型者形成“袖套”状改变，血管周围白质片状脱髓鞘改变。见图 1A、图 1B。

2.3 CD44表达情况

正常对照组大鼠CNS内未发现CD44阳性细胞。EAE对照组大鼠CNS白质及灰白质交界处可见大量CD44阳性细胞，主要分布在神经细胞胞浆，部分间质细胞亦有表达，呈棕黄色颗粒，染色深。CD44高表达部位的炎症表现较重。图像分析结果显示, EAE组CD44平均光密度值为0.28±0.006。见图 2A、图 2B。

2.4 EAE组CD44表达与发病潜伏期、进展期及高峰期神经功能障碍评分相关分析

结果显示：EAE组发病高峰期CD44表达与发病潜伏期呈负相关(P < 0.01)；与进展期呈正相关(P < 0.01)；与发病高峰期神经功能障碍评分呈正相关(P < 0.01)。见表 1。

3 讨论

EAE作为一种中枢神经系统自身免疫性脱髓鞘病变模型，是世界公认的研究人类MS的动物模型。较多研究证实，EAE是细胞免疫及体液免疫均参与的错综复杂的病理免疫过程，以细胞免疫为主^[8]；自身免疫性T细胞从外周迁移CNS可以破坏生理性免疫豁免^[9]。CD44分子是细胞表面跨膜蛋白多糖的一个家族，广泛表达于多种细胞上，包括B淋巴细胞、T淋巴细胞、单核巨噬细胞、内皮细胞及成纤维细胞等，主要参与细胞﹣细胞、细胞﹣基质之间的黏附。CD44分子的配体为细胞外基质，主要有透明质酸、层粘连蛋白、纤粘连蛋白和胶原蛋白等多种配体。T细胞上的CD44与其配体结合可促进T细胞的黏附，诱导IL-2产生，增加T细胞的活性；而单核细胞的CD44与配体结合则使IL-1释放增多，促进单核细胞的聚集，从而促进免疫反应。

目前可见多种自身免疫性疾病(如银屑病、系统性红斑狼疮等)CD44表达增加的报道。近年来国外已开始有关CD44在EAE中的研究。Kim等^[10]经过对EAE大鼠脊髓进行研究发现，CD44在星形胶质细胞及炎性细胞中表达明显增加，促进EAE的发生发展。Garin等^[11]通过向EAE大鼠体内接种CD44的干扰基因，抑制CD44的表达，发现EAE的严重程度明显减轻，其病理结果提示中枢神经系统损害明显减轻，浸润细胞凋亡增加。以上研究提示黏附分子CD44有促进EAE发生发展的作用。但目前CD44分子对EAE的作用机制尚不明确。Clemente等^[12]研究发现，骨桥蛋白在EAE的复发中有重要的作用，其分子C端与黏附分子CD44结合，可下调IL-10的表达，抑制淋巴细胞的凋亡，故CD44分子有可能通过骨桥蛋白通路促进EAE复发。Chang等^[13]研究表明，CD44、透明质酸及多功能蛋白聚糖等分子可能被白质的星型胶质细胞上调，这些分子形成络合物，抑制少突胶质细胞的成熟和髓鞘的再生，提示CD44可能通过皮层髓鞘再生减少而促进EAE发病。Chitrala等^[14]通过将CD44基因敲除的老鼠的排泄物移入CD44野生型的EAE大鼠发现，EAE症状的明显减轻；经对肠道菌群高通量细菌16 S rRNA基因测序，EAE CD44基因敲除大鼠与CD44野生型EAE大鼠比较，显示出显著的多样性、丰富性和均匀性；故其研究结论认为CD44基因缺失的小鼠，可能通过改变肠道微生物群和不饱和短链脂肪酸而导致EAE的缓解，此研究为CD44在EAE中的作用机制提出了全新的观点。Winkler等^[15]研究指出，中枢神经系统血管内皮细胞淋巴细胞溢出是炎性脱髓鞘疾病(包括MS及EAE)的关键步骤。葡糖胺聚糖透明质酸(glycosaminoglycan hyaluronan, HA)与其受体脑血管内皮细胞上的CD44分子结合，对于激活T细胞进入中枢神经系统至关重要，这也为CNS炎性脱髓鞘的机制提供了新的见解。上述研究均表明，CD44分子可能通过多种机制在EAE的发病中起着促进作用。

但同时，也有研究得出了相反的结论。Flynn等^[16]通过研究却发现，CD44缺乏的EAE小鼠与野生型比较，其临床症状更重、中枢神经系统的免疫细胞数量及细胞因子含量更多，其研究结论认为CD44分子可能通过作用于细胞因子的产生、T细胞的分化，T细胞内皮细胞的相互作用、以及血脑屏障的完整性而发挥对EAE的保护作用。故目前CD44在EAE中的作用尚无一致定论。

本研究结果提示，EAE组大鼠经过一定潜伏期后均出现不同程度的EAE症状，且其神经组织病理切片检查证实存在脱髓鞘改变及炎性细胞浸润，符合EAE病理表现，提示造模成功；采用免疫组化技术对正常对照组、EAE组大鼠脑和脊髓白质组织表达CD44的阳性细胞进行了检测，结果显示正常对照组大鼠脑和脊髓白质组织未发现CD44表达的阳性细胞，EAE对照组大鼠脑和脊髓白质组织可见大量CD44表达的阳性细胞，主要分布在大脑、脑干、脊髓白质及灰白质交界的小血管周围。相关性分析显示，EAE对照组大鼠发病高峰期CD44表达量与EAE发病的潜伏期呈负相关，与进展期和高峰期神经功能障碍评分呈正相关。提示EAE大鼠中枢神经系统存在CD44分子的过度表达，且表达程度与EAE大鼠发生、发展及病情程度密切相关；此研究结果与之前大多数研究(认为CD44对EAE具有发病具有促进作用)相一致。但本研究只是对CD44在EAE中的表达情况进行了初步探索，尚未对其机制进行深入研究。总的来说，目前CD44在EAE中的作用尚无定论，且其机制尚不清楚，值得深入探讨。