缺血性脑卒中(ischemic stroke, IS)是由于大脑主要供血动脉内血栓形成或栓塞引起局部血流灌注突然减少或中断而引起的神经结构和功能障碍性疾病，具有高致残率和高病死率，溶栓治疗是目前临床上唯一有效的治疗方法。由于溶栓治疗的适用范围窄和并发症多等原因，实际治疗获益患者很少，故迫切需要开发新的临床有效的IS治疗途径。微小RNA(microRNA, miRNA)是一类高度保守的内源性非编码RNA分子，由18~25个碱基组成，通过与目标mRNA的3'端非翻译区(3'-untranslated region, 3′-UTR)结合在转录后水平负调控蛋白质的表达。研究表明，miRNA在中枢神经系统的发育、生理活动及IS的病理过程中均发挥关键的调节作用^{[1, 2]}，成为潜在的IS防治靶点。通过特异性的药物或非药物手段促进或抑制IS相关miRNA的表达可能是一种有效的IS治疗途径。本文重点综述了miRNA在调节IS诱导的内源性神经再生方面的相关研究进展及其在临床上的潜在治疗价值，为进一步深入研究miRNA用于促进内源性神经修复治疗IS奠定基础。

1 IS诱导的内源性神经再生

研究表明，成年哺乳动物的脑内存在神经干细胞/神经祖细胞(neural stem cell/ neural progenitor cell, NSPC)，在脑缺血等刺激下能够被激活，诱导内源性神经再生，参与脑损伤的修复^[3-6]。内源性NSPC的发现为利用内源性细胞代替缺血坏死神经细胞、治疗IS并修复神经缺失成为可能。理论上，若有足够的新生神经元可以替代坏死神经元并有效地整合入脑组织中，就有可能恢复脑缺血后缺失的神经功能；基于内源性NSPC的细胞替代治疗不受细胞数量和时间限制，其增殖和分化不会引起任何免疫反应或副作用，无继发性出血等风险，因而通过增强内源性神经再生治疗IS是最理想的途径。但是，成年期的NSPC的活性受年龄等因素影响，其增殖能力随年龄增长而下降，单纯IS诱导的内源性神经再生不能完全恢复受损脑区功能^[7]。因此，如何促进内源性神经再生从而实现IS的临床治疗成为新的研究热点。

前期研究证实，神经营养药物、针灸、电磁刺激、体育锻炼和丰富环境等可以增强IS诱导的内源性神经再生和促进神经功能的恢复^{[3, 6, 7]}。但尚未见到通过增强内源性神经再生改善中风患者神经功能的临床成功案例报道，因此，进一步阐明内源性神经再生的机制将有助于发现新的IS治疗靶点。

2 miRNA对内源性神经再生的调节作用

研究表明，IS可能通过激活NSPC内的磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)、Wnt、Notch及音猬因子(sonic hedgehog, SHH)等信号通路诱导细胞增殖和神经再生^[7]。因此，只要能够增强这些信号通路相关分子的功能，就可以促进神经再生。miRNA能够结合mRNA的3'-UTR在转录后水平调节蛋白质的表达，因而可以调节参与神经再生的信号通路。研究表明，miRNA参与了IS的各个环节，对IS后的神经再生修复有重要的调节作用，有可能成为IS的重要防治靶点^{[1, 2]}。已报道的与IS诱导的内源性神经再生密切相关的miRNA主要有miRNA-124(miR-124)、miRNA-17-92基因簇(miR-17-92)、miRNA-9(miR-9)、miRNA-210(miR-210)、miRNA-25(miR-25)等。

2.1 miR-124

miR-124特异性表达于神经元内，是脑内含量最丰富的miRNA之一。miR-124在神经分化后开始表达，在成熟的神经元中持续高水平表达^[8]。miR-124对成年动物脑室下区(subventricular zone, SVZ)的神经元命运有决定作用，可以通过下调SRY同源盒转录因子(sry-box 9, Sox9)促进NSPC向神经元分化^{[2, 8]}。miR-124通过作用于JAG1/Notch信号通路调节IS诱导的内源性神经再生^[9]。在脑缺血的情况下，miR-124a的表达下调，靶基因JAG1表达增加，Notch通路被激活，刺激SVZ区的NSPC增殖；NSPC内miR-124表达上调则显著降低了JAG1转录子及蛋白质水平，促进了Notch信号通路下游的p27Kip1的表达，使Notch信号灭活，从而抵消了脑缺血诱导的NSPC增殖作用，促进NSPC向神经元分化^{[1, 2, 9]}。另外，miR-124还可以通过降低肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和抑制小胶质细胞活化发挥神经保护作用^[1]。

2.2 miR-17-92基因簇

miR-17-92基因簇是目前为止研究最深入的一个miRNA基因簇，位于人类第13号染色体上一个长约0.8 kb的区域，被作为一个多顺反子转录，最终产生6个成熟的miRNA(miR-17、miR-18、miR-19a、miR-20、miR19b-1和miR-92a-1)^[10]。miR-17-92基因可以同时作用于NSPC和血管内皮细胞(endothelial cell, EC)，具有促进神经再生和血管形成的双重作用，在大脑皮质的发育及成年期的神经再生中均发挥重要调节作用，被认为是中枢神经系统损伤的重要治疗靶点^[10-12]。miR-17-92通过抑制磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog, PTEN)和T-box蛋白(Tbr2 protein, Tbr2)调节大脑皮质放射状胶质细胞及中间神经前体细胞的数量在大脑皮质的发育中发挥重要调节作用^[10]。miR-17-92持续表达于成年脑的SVZ和齿状回的颗粒下层(subgranular zone, SGZ)，对海马的神经再生起关键作用^[10]。脑缺血可以显著上调缺血侧SVZ区NSPC内miR-18a、miR-19a、miR-19b和miR-92a的表达^{[9, 11]}。miR-18a和miR-19a表达上调能促进缺血NSPC的增殖，反之表达下调会抑制NSPC增殖和促进神经细胞死亡^[11]。miR-17-92过表达可以通过阻断LIF/CNTF-JAK-STAT信号传导通路促进神经再生，改善脑部损伤小鼠的运动协调功能^[10]。miR-17-92的功能与SHH通路密切相关，SHH可显著上调缺血NSPC内的转录因子c-Myc蛋白的水平，后者可以通过与miR-17-92的启动子区结合促进miR-18a、miR-19a和miR-92a表达；SHH的信号通路被阻断后，miR-17-92和c-Myc蛋白的水平下降^[11]。miR-17-92还可以通过抑制PTEN激活PI3K通路，促进缺血半影区神经可塑性和神经功能的恢复^[13]。另外，miR-17-92还可以通过作用于EC内的PTEN促进EC增殖和新血管生成^[12]。在IS后的神经修复过程中，神经再生和新血管生成是同步发生的，新血管的生成有利于再生神经细胞的存活和神经功能的恢复。

2.3 miR-9

miR-9特异性表达于脑内各个神经发生区域，通过作用于核受体TLX抑制NSPC的增殖和加速NSPC向神经元方向分化，并通过调节血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A, VEGF-A)的表达调节脑和视网膜内神经血管网络的形成，在脑发育中起关键作用^[14]。在成年脑内，miR-9只表达于静止状态NSPC内，通过增强Notch信号通路使NSPC处于静止状态，对维持成年期静止状态和激活状态的NSPC之间的平衡起着关键的作用^[15]。脑缺血性损伤可以下调miR-9的表达，补充miR-9后可以通过作用于Bcl-2样蛋白11发挥神经保护作用^[16]。最新研究表明，miR-9和miR-124可能是脑卒中后诱导神经发生的核心调控因子。miR-9、miR-124、核受体TLX、B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2, BCL2)和组蛋白脱乙酰酶4基因(histone deacetylase 4, HDAC4)之间相互作用，构成了IS后神经再生的正反馈环路^[17]。

2.4 miR-210

miR-210是一种低氧激活的多功能因子，其表达在所有经过低氧处理的细胞中均显著上调，被称为低氧标志性miRNA。研究表明，miR-210是与IS密切相关的关键miRNA之一，对IS病程发展及预后起重要的作用^{[18, 19]}。脑缺血情况下，miR-210的表达显著上调，可以激活Notch1信号传导通路和促进血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的表达，诱导血管生成和神经再生^[18]。持续高表达miR-210可以上调缺血﹣再灌注损伤脑组织内脑源性神经生长因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)的表达，促进损伤脑区血管和神经再生，改善神经功能^[19]。

2.5 miR-25

miR-25是miR-106b-25的成员之一，在个体发育及多种疾病的发生发展中起重要的作用，miR-25可能通过胰岛素/胰岛素样生长因子信号通路调控成年NSPC的增殖和分化^[20]。敲除miR-25基因会抑制NSPC的增殖，异位表达miR-25可以促进NSPC的增殖^[20]。重复经颅磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation, rTMS)可以上调大鼠脑缺血皮质miR-25的表达和同侧SVZ内NSPCs的增殖，并伴有p57表达的下调；在rTMS治疗前先注射miR-25拮抗剂，则p57表达上调，NSPC增殖受到抑制，提示miR-25通过负调控p57表达促进神经再生^[21]。另外，miR-25还通过下调Fas/FasL通路在IS中发挥神经保护作用^[22]。

2.6 其它神经再生相关的miRNAs

miRNA-148b(miR-148b)可以通过下调Wnt信号通路抑制内源性NSPC的增殖和分化^[23]。脑缺血可以显著上调SVZ内miR-148b的表达，给予miR-148b抑制剂后，Wnt-1、β-连环蛋白(β-catenin)和细胞周期蛋白D1的表达增加，促进NSPC增殖和向神经元及星形胶质细胞转化，减小缺血病灶，改善神经功能；而敲除Wnt-1后则miR-148b抑制剂的上述功能消失^[23]。对盒基因(PAX6)是miRNA-365(miR-365)的直接靶基因，可以促进星形胶质细胞向神经元转化。脑缺血性损伤可以显著上调miR-365的表达，经侧脑室注射miR-365拮抗剂可以显著增加缺血纹状体星形胶质细胞中PAX6的表达和星形胶质细胞来源的成熟神经元的数量，减轻脑损伤；而miR-365激动剂则下调PAX6的表达和神经再生，加重脑损伤^[24]。

3 miRNA对IS的治疗应用及存在问题

鉴于miRNA在IS诱导的内源性神经再生和血管形成中的重要调节作用，通过增强或抑制某些特异性miRNA的功能促进内源性神经修复将是一种有效的IS临床治疗途径。前期的研究在miRNA的修饰、药物载体及给药途径方面做了一些探索。miRNA模拟剂(mimic)和抑制剂(inhibitor)是研究miRNA功能最常用的药物形式^[23]，这种剂型免疫原性小，制备方便，但是易被内源性RNA酶降解；miRNA的激动剂(agomir)和拮抗剂(antagomir)是另外一种常用的药物形式^{[1, 24]}，这种剂型中的寡核苷酸分子经过了化学修饰，稳定性较好，但是化学修饰有可能增加机体免疫排斥的风险。miRNA进入动物体内的常用给药途径有以下几种：①miRNA经转染脂质体包装后，通过侧脑室或纹状体注射给药^{[23, 24]}，是最常用的方式，这种给药的优势是药物直接作用于局部，损失少，容易控制剂量，但是具有创伤性，不适合中风病人的临床治疗。②利用腺病毒载体或慢病毒载体包装miRNA经鼻或静脉注射系统给药^{[1, 19]}，病毒载体能够有效通过血脑屏障并且在体内持续表达和释放，从而实现miRNA的持续高表达或抑制。③利用外泌体作为miRNA载体^{[13, 25]}，外泌体为纳米级的小囊泡结构，可以通过血脑屏障，稳定性好，可以全身给药。如将外泌体RVG-Exos-miR-124经尾静脉给药能够有效促进内源性NSPC向神经元分化。④纳米颗粒载体^[26]，如由纳米颗粒包装的miR-124在体外经静脉给药后，可以有效抵达脑实质，能够被组织细胞吞噬内化。虽然后三种药物载体均可以经全身给药有效递送至缺血脑部，但是由于miRNA能够同时作用于多个靶基因，其对其它器官系统的潜在副作用还有待研究。另外，miRNA激动剂或抑制剂在什么时间窗给药才能达到有效治疗效果也需要进一步研究。如在手术前14 d转染含有miR-210的腺病毒表达载体可以促进局灶性脑缺血/再灌注大鼠损伤脑区的神经再生，改善神经功能^[19]；而在术前24 h或术后4 h经侧脑室注射miR-210抑制剂则可以抑制炎症反应和减轻脑损伤^[27]。

4 结论

miRNA在IS的病理过程中发挥重要调控作用，研究miRNA对内源性NSPC的增殖和分化作用有助于阐明中风的内源性神经修复机制和发现新的治疗靶点。已有的研究表明，miR-124、miR-17-92和miR-9对内源性神经再生的调节作用最显著，miR-124和miR-9可能是内源性神经再生的核心调控因子。miRNA具有分子小、容易操作、转录后作用迅速的特点；一个miRNA分子可以识别和调控多个mRNA，从而发挥强大的调控作用，因此利用药物或非药物手段调节特异性miRNA增强IS诱导的内源性神经再生可能是IS的有效治疗途径。由于miRNA很容易被RNA酶降解，作用靶点多，可能会降低其药效及对其它器官系统产生意想不到的副作用。miRNA作为中风治疗用药，其给药方式、给药途径和给药时间方面是未来的研究方向。