胶质瘤是高度血管化的恶性实体瘤，侵袭性高、预后差，中位生存期仅12~15月^[1]。传统的抗血管生成药物主要针对内皮依赖性血管，临床疗效并不理想。血管生成拟态(Vasculogenic mimicry，VM)作为一种不依赖机体血管内皮细胞的全新的血流灌注系统，形态学上由肿瘤细胞和基底膜构成具有微循环功能的网状结构，研究显示VM与肿瘤恶性程度、预后及抗血管治疗效果不理想密切相关，但关于VM机制十分复杂，多种因素及信号通路参与其中。本文将对VM在胶质瘤中的机制以及在此基础上研发的抗VM治疗方法进行综述。

1 VM形成机制

研究显示VM形成需要多种因素参与，包括肿瘤微环境、干细胞、上皮间质转化及TGF-β、VE-cadherin、EphA 2、MMPs、LRIG1、COX-2、VEGFR-2、MIF、miRNA等分子参与的多条信号通路。

1.1 肿瘤微环境

肿瘤微环境是指肿瘤细胞在生长过程中所处的局部微环境，主要特征为间质高压，低氧分压、低PH、大量生长因子、蛋白水解酶及炎性物质等。不同微环境影响肿瘤VM及相关生物学行为，如增殖、迁移、侵袭等。目前关于胶质瘤微环境的研究主要集中在细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)重塑和缺氧两方面。

1.1.1 细胞外基质重塑

细胞外基质主要包括MMPs、LN5γ2、整合素、免疫球蛋白类粘附分子、硫酸肝素、热休克蛋白、组织因子等。研究显示MMP-2、MMP-9、MMP-14及LN5γ2均参与了胶质瘤VM形成。凌耿强等^[2]通过缺氧培养、添加U251上清、U251细胞处理Matrigel等方法分别诱导SHG44胶质瘤细胞，发现不同微环境下均能形成VM。据此推测胶质瘤VM形成可能是微环境改变后多种因素共同作用的结果。

1.1.2 缺氧

大多数恶性实体瘤进展过程中均存在缺血、缺氧现象。早期认为只有恶性程度较高的胶质瘤可形成VM，如U251MG、U87细胞；而低度恶性胶质瘤不能形成VM，如SHG44细胞。但张熙^[3]等通过化学缺氧法诱导低侵袭性SHG44胶质瘤细胞形成VM，且肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭能力增强。后期学者们通过缺氧箱培养、二氯化钴模拟缺氧等方法均可诱导低侵袭性胶质瘤形成VM。缺氧条件下缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)高表达，与VE-cadherin启动子上游区域中的缺氧反应元件(HRE)结合而激活，激活的VE-cadherin通过EphA2/PI3K/MMPs/ LN5γ2通路调控VM形成^[4]。

2 胶质瘤干细胞(glioma stem cells, GSCs)

GSCs具备自我更新、多向分化潜能、可塑性和胚胎样细胞表型，主要表达CD133、Nestin等干细胞标志分子。在特定的微环境中，胶质瘤干细胞失去原有“干性”可定向分化为内皮细胞或血管平滑肌样细胞，参与肿瘤血管生成。Dong等^[5]发现胶质瘤干祖细胞(human glioma stem/progenitor cells，hGSPCs)在体外缺氧条件下形成毛细血管样结构，且表达血管内皮细胞标志蛋白(CD31、CD34、KDR和vWF)。提示胶质瘤干祖细胞转分化为内皮细胞。当GSCs在添加了VEGF的培养基中可形成呈典型的石板样形态的VM，其超微结构与血管内皮细胞相似。Scully等^[6]证实GSCs形成VM过程中可转分化为血管平滑肌样细胞，表达血管壁标记物SMa、PDGFRβ、EGFR、VEGFR-2。Chang等^[7]通过对免疫缺陷小鼠皮下和原位注射人胶质母细胞瘤移植瘤的分析，发现移植瘤血管主要由内皮细胞异常的肿瘤细胞和内皮细胞共同组成。研究结果表明，这些肿瘤细胞来源于具有多向分化能力的CSCs，因此VM可能代表肿瘤干细胞向内皮细胞的不完全分化。

3 上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)

EMT是一个动态的生物学过程，通过极化上皮细胞使其失去其上皮特性，并获得间充质细胞特性以及细胞形态的改变。上皮间质转换的特征是接触抑制、细胞外基质重塑和细胞骨架的重组。EMT在恶性肿瘤的进展和VM的形成中起着至关重要的作用。在EMT过程中，E-cadherin等上皮标记物的表达下调，Vimentin等间充质标记物的表达上调。研究显示缺氧条件下U87和U 251胶质瘤细胞可形成VM，此时HIF-1α、MIF和CXCR 4表达增加，与EMT相关的间充质标记物N-cadherin、Vimentin表达增加，而上皮标记物E-cadherin表达下降或几乎不表达。说明胶质母细胞瘤形成VM与EMT密切相关^[8]。TGF-β是目前公认的调节EMT的主要因子，Ling等^[9]研究发现TGF-β主要通过诱导上皮间质转化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)参与VM形成。其机制很可能是通过激活MMP-LN5γ2通路引起EMT和ECM重塑使肿瘤细胞可塑性增强。不过最新的研究表明，肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs)和上皮-内皮细胞转换(epithelium-to-endothelium transition, EET)是EMT过渡的一种亚型，通过刺激肿瘤细胞的可塑性、重塑细胞外基质以及将VM通道与宿主血管连接，从而促进VM的形成^[10]。

4 VM相关信号通路及参与分子 4.1 TGF-β1信号通路

TGF-β1是肿瘤血管发生过程中的一种多功能细胞因子。Huang等^[14]发现在相同的三维培养条件下，VM阳性的胶质瘤细胞系U251MG与VM阴性的SHG44相比，TGF-β1表达明显升高。进一步通过基因沉默U251MG细胞中TGF-β1表达可抑制了VM形成，然而转染了TGF-β1的SHG44胶质瘤细胞可以形成VM。据此证实了TGF-β在VM形成中的重要作用。Zhang等^[11]采用qRT-PCR和ELISA法检测正常人星形胶质瘤细胞(normal human astrocytes，NHA)细胞和NHA/ A 172共培养胶质瘤细胞系中TGF-β1 mRNA水平均升高，提示NHA通过分泌TGF-β1促进胶质瘤细胞株A172VM的形成。

4.2 EphA2/PI3K/MMPs/ LN5γ2信号通路

EphA2是酪氨酸蛋白激酶受体家族成员之一，调节肿瘤细胞的增殖、迁移和血管生成。VE-cadherin是内皮细胞特异性表达的一种跨膜糖蛋白，属于钙粘家族之一，是VM形成中最早发现的分子之一。VM阳性的胶质瘤细胞中VE-cadherin能在相邻肿瘤细胞间同型结合，使EphA2局限于细胞膜。EphA2与相邻肿瘤细胞膜配体Ephrin-A1结合后发生磷酸化，磷酸化的EphA2激活PI3K(磷脂酰肌醇-3-激酶)，活化的PI3K使4, 5-二磷酸肌醇磷酸化生成3, 4, 5-三磷酸肌醇，进一步促进MPP2和MTI-MMP的表达，后两者共同作用下使LN 5γ2分解为γ2x和γ2，最终促进VM形成^{[4, 12]}。

4.3 RTK/PI3K/Akt/mTOR

RTK是酪氨酸蛋白激酶受体，属于单跨膜受体，具有胞外N端配体结合结构域和胞内C-末端区催化结构域。PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，且PI3K本身具有丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)激酶的活性，也具有磷脂酰肌醇激酶的活性，由调节亚基p85和催化亚基p110构成。P85和RTK的结合激活催化亚基(P110)，从而催化PIP 3，4-二磷酸(PIP 2)磷酸化为3，4，5-三磷酸(PIP 3)。PIP 3反过来激活磷酸肌醇依赖性激酶-1(PDK 1)，后者通过磷酸化特定的氨基酸位点激活Akt，激活后的Akt使其下游底物mTOR直接磷酸化，后者能够激活Akt信号级联放大的因子，包括受体酪氨酸激酶、整合素、B细胞和T细胞受体、细胞因子受体、G蛋白偶联受体，以及其他能够通过PI3K诱发PIP3生成的刺激因子^[13]。Huang等^[14]发现在体外培养条件下，U87恶性胶质母细胞瘤细胞在Matrigel上形成类似于脐静脉内皮细胞的管状结构，mTOR特异性抑制剂雷帕霉素抑制U87恶性胶质母细胞瘤细胞在常氧和缺氧条件下VM的形成。此外，雷帕霉素和mTOR siRNA还能抑制VM形成的信号级联，尤其是HIF-1α。以上结果均表明mTOR信号参与了VM的形成。因此，RTK/PI3K/Akt/mTOR信号通路在胶质瘤中的研究较为明确。

4.4 LRIG 1

富含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白样结构域(leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domain 1, LRIG-1)，是表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)信号通路的调节因子，是肿瘤发生过程中的抑癌蛋白。Zhang等^[15]将LRIG 1转染到SHG-44胶质瘤细胞中，发现LRIG 1能抑制缺氧诱导的VM形成和VM依赖的恶性行为，机制可能是抑制EGFR/PI3K/AKT信号通路和EMT过程。然而，在胶质瘤细胞中应用siRNA技术下调LRIG1可以激活EGFR、AKT，并促进肿瘤的VM相关恶性生物学行为。

4.5 COX-2

环氧化酶-2(cyclooxxygenase-2，COX-2)是前列腺素E2的限速酶。常氧条件下通过三维培养发现能形成VM的高侵袭性脑胶质瘤细胞株表现出较高的COX-2表达，而非侵袭性细胞株则没有这种生物学现象。另外，应用COX-2抑制剂Celecoxib或特异性siRNAs抑制COX-2对VM的形成有显著的抑制作用^[16]，提示COX-2在VM结构的形成中起着重要的作用。

4.6 VEGFR-2

血管内皮细胞生长因子受体2(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2，VEGFR-2)又称Flk-1/KDR，属于酪氨酸蛋白激酶受体家族，主要在血管内皮细胞、造血干细胞和肿瘤干细胞中表达。VEGFR-2与胶质瘤VM形成密切相关，GSCs通过分泌VEGF，与自身表面的血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)结合并发生磷酸化参与VM形成。Yao等^[17]发现在GSCs形成VM过程中VEGFR-2高表达，用shnRNA敲除GSCs中的VEGFR-2，并通过小鼠异位移植瘤模型发现转染了VEGFR-2 shRNA的胶质瘤干细胞VM形成数量为未转染组的60%，说明VEGFR-2介导了干细胞VM的形成。

4.7 MIF

巨噬细胞迁移抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor，MIF)是一种结构独特的细胞因子，具有促炎和促肿瘤作用。暴露在缺氧环境下的胶质瘤(U87和U251)MIF表达增加，MIF通过CXCR4/AKT/EMT途径调节缺氧诱导的GBM细胞VM的形成。缺氧诱导的MIF和CXCR 4的过度表达与胶质瘤的分级呈正相关，MIF已被报道为胶质瘤患者预后的独立预测因子^[18]。

4.8 miRNA

微小RNA(microRNA，miRNA)由RNA聚合酶Ⅱ合成的非编码RNA，可结合到mRNA上抑制转录，也可直接降解目标mRNA。Li等^[19]采用RT-PCR法检测到人胶质瘤中miR-141的表达下调，EphA 2表达上调，两者在胶质瘤Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级中的表达水平呈负相关。另外，外源性miR-141的表达能抑制肿瘤的生长，抑制VM的生产。同样地，miR-26b可抑制EphA 2调控的VM过程。Xu等^[20]发现miR-584-3p通过对抗缺氧诱导的ROCK 1依赖的应力纤维形成而抑制肿瘤细胞的VM。Song等^[21]发现miRNA-9通过抑制Notch信号通路阻碍VM形成。多项研究证实miRNA可能对脑胶质瘤具有抑癌作用。Gao等^[22]发现通过基因敲除长链非编码RNA Hoxa-AS2可抑制恶性胶质瘤VM形成和相关生物学行为，并证实miR-373/EGFR轴参与了该生物学过程。另外，研究发现miRNA21与胶质瘤的迁移、侵袭、增殖及预后相关，与VM相关的分子如MMPs、EGFR及TGF-β/Smad信号通路等均密切相关，但文献尚无miRNA21与VM形成的相关报道^[23]。

5 抗VM治疗

目前在胶质瘤治疗的研究中，基于以上分子机制，现有的抗VM治疗主要针对MMPs、HIF-1a、RTK及其他(TGF-β1、mTOR、Mig-7、LRIG1等)采用相应抑制剂或基因沉默相关分子。

5.1 MMPs

Ling等^[24]用全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)体外处理U87胶质瘤细胞，随着培养液中ATRA浓度逐渐增高，U87细胞形成VM的能力减弱。其可能机制为ATRA的下游NF-κB通路受阻，MMP-2活性下降致VM形成受阻。黄树赟等^[25]发现阿托伐他汀可能通过对U87细胞MMP-2表达的抑制，从而影响VM形成。郭世文、张熙等研究团队通过体内外试验证实Alphastatin能够同时抑制内皮细胞依赖性血管和血管生成拟态, 其机制可能是抑制EphA2/MMPs/LN5γ2通路的活性^[26-27]。

5.2 HIF-1α

肿瘤细胞在缺氧微环境下HIF-1α高表达，并通过直接或间接调节VE-cadherin、EphA 2和LN5γ2基因的表达来促进VM的形成，当应用siRNA干扰沉默HIF-1a基因后VM形成明显受阻^{[4, 12]}。另外，研究显示HIF-1α是由哺乳动物的雷帕霉素通过mTOR信号通路调控的，Huang等^[14]用mTOR特异性抑制剂雷帕霉素抑制U87恶性胶质母细胞瘤细胞在缺氧条件下VM的形成。

5.3 RTK

受体酪氨酸激酶(Receptor Tyrosine Kinase, RTK)胞外受体主要包括各种生长因子受体，如成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor，FGFR)、血管内皮细胞生长因子受体(vascularendothelial growth factor receptor，VEGFR)、胰岛素和胰岛素样生长因子-1受体(insulin and insulin-like growth factor-1 receptor，IGF-1R)等。李潇等^[28]通过体内外实验发现FGFR抑制剂BGJ398处理人胶质瘤细胞株U87MG和U251MG可以抑制胶质瘤细胞形成VM，其可能机制与阻断FGFR通路，下调MMP2和MMP14的表达有关。贝伐单抗(bevacizumab，Bev)是血管内皮生长因子受体抑制剂，理论上可以抑制肿瘤血管生长。但是，Xue等^[29]采用组织病理学和动态增强MRI(DCE-MRI)技术研究贝伐单抗对U87MG小鼠血管生成作用时发现，Bev治疗后第6天VM明显增加。Gariboldi等^[30]研究U-87 MG人胶质瘤细胞系中IGF-HIF1-VEGF轴的表达，使用IGF1R特异性抑制剂NVP-AEW 541阻断IGF-HIF1-VEGF通路，最终抑制胶质细胞瘤的增殖和血管生成能力。Yao等^[17]通过体内外实验证实转染了VEGFR2 shRNA的胶质瘤干细胞VM形成受到明显抑制。

5.4 其他

Ling等^[9]采用不同浓度TGF-β中和抗体处理U251胶质瘤细胞，结果显示抑制TGF-β信号通路可以使胶质瘤VM形成能力下降，这可能与VEGF及PDGF表达减少有关。Huang等^[14]在体外培养条件下证实mTOR参与了U87胶质瘤细胞的VM形成过程，并应用mTOR特异性抑制剂雷帕霉素和mTOR siRNA抑制了VM的形成。Zhang等^[15]发现LRIG 1通过抑制EGFR/PI3K/AKT通路抑制缺氧诱导的VM形成。Liu等^[16]应用COX-2抑制剂Celecoxib或特异性siRNAs抑制COX-2发现VM形成受到显著抑制。胡昌建等^[30]采用慢病毒转染将Mig-7-shRNA转入U87胶质瘤细胞中，发现其VM形成及侵袭能力明显降低，这可能与Mig-7基因沉默后下调PI3K、AK, p-AKT、MMP-2和MMP-9的表达有关。

6 总结

胶质瘤是成人神经系统最常见的恶性肿瘤之一，临床预后差。目前传统的抗血管生成药物主要抑制内皮细胞增殖和/或向低氧区迁移，从而使肿瘤组织缺血、缺氧，实际上不仅达不到“饿死”肿瘤的目的，还会诱导肿瘤细胞代偿性的形成VM，从而增加了肿瘤的恶性生物学行为，在临床应用中结果令人失望。VM可能是一种重要的肿瘤存活机制，在肿瘤进展早期可能完全剥夺肿瘤的血液供应。而且VM通道独特的结构直接将通道内表面的肿瘤细胞暴露在血管中，从而促进肿瘤的转移。许多研究表明VM与胶质瘤患者预后密切相关，可作为预后的独立预测因子。因此，针对VM的研究是目前热点之一，但关于VM形成包括肿瘤微环境、干细胞、上皮间质转化等因素及各种信号通路均有参与，通过阻断其中某一环节并不能使VM形成完全受阻。所以需要研究者们继续努力以期发现有效的抗VM靶向药物，为治疗肿瘤带来新希望。