癫痫是神经科的常见疾病，对于每次不可避免的癫痫发作，发作后引起神经元损伤并没因癫痫发作的停止而终止^[1]，于发作后尽快采取有效的脑保护措施是非常重要的。大黄素是中药大黄的主要成分之一，有泻下攻积，清热泻火，解毒，活血祛瘀和抗癌等功效^[2]。近期有文献报道大黄素可有效降低脑缺血再灌注损伤和颅脑爆震伤所引发的二次损伤^{[3, 4]}，但在癫痫防治中是否同样具有此功能，目前报道甚少。本研究采用海人酸建立小鼠癫痫持续状态(SE)模型，研究大黄素对癫痫后海马神经细胞的保护作用，并初步探讨其作用机制。

1 材料与方法 1.1 动物分组

由上海斯莱克实验动物中心提供的ICR健康雄性小鼠90只(许可证号：SCXK(沪)2007-0005)，体重23~28 g。随机分对照组、癫痫持续状态(SE)组和大黄素治疗组(分为100、200和400 mg/kg组)共5个组，每组18只。

1.2 主要药品、试剂与仪器

海人酸(美国BIOMOL公司)；大黄素(美国sigma公司)；TUNEL试剂盒(Roche试剂公司)；RT-PCR试剂盒(美国Promega公司)；TBARS试剂盒(CAYMAN公司)；谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活力测定试剂盒(南京建成生物公司)；兔抗鼠IL-1β、TNF-a、caspase-3多克隆抗体(Santa Cruz公司)。

1.3 方法 1.3.1 制模与给药

采用腹腔内注入海人酸(12 mg/kg)建立小鼠癫痫持续状态模型。按Racines^[5]分级标准评价癫痫行为：0级：正常行为；Ⅰ级：面部肌肉痉挛表现为咀嚼运动、眨眼和动须等，湿狗样颤动。Ⅱ级：颈部肌肉痉挛表现为点头运动。Ⅲ级：一侧前肢阵挛。Ⅳ级：站立伴双前肢阵挛。Ⅴ级：在Ⅳ级的基础上身体向后倒下失去平衡，四肢抽动。达到Ⅲ级改变以上者定为癫痫发作，连续的痫性发作超过30 min以上者为SE。

制模成功后大黄素治疗组分别以100、200和400 mg/kg的剂量(溶于生理盐水)腹腔注射大黄素。癫痫持续状态组和对照组注入等量的生理盐水。

1.3.2 标本制备

制模24 h后各组取6只ICR小鼠，麻醉后，心脏灌注4%多聚甲醛，取脑并浸泡过夜。常规石蜡切片，用于HE和TUNEL染色；每组另取12只ICR小鼠，麻醉后断头取双侧海马，分别用于Western blot和RT-PCR对GSH、SOD和MDA的测定。

1.3.3 HE染色

石蜡切片常规脱蜡脱水，HE染色观察海马CA1和CA3区神经细胞的病理形态学变化。

1.3.4 TUNEL法检测神经元凋亡

按TUNEL试剂盒说明书进行染色与检测。光镜下选择海马CA3区比较观察各个视野棕黄色TUNEL阳性细胞，并计数连续3张脑切片整个CA3区TUNEL阳性细胞数，在200倍视野计算平均阳性细胞百分数。

1.3.5 海马组织GSH和MDA含量及SOD活力的测定

取海马组织组织块重量9倍体积的匀浆介质加入海马组织并研碎。将制备好的10%的匀浆用低温离心机离心12 min，取上清。严格按试剂盒说明书检测上清液中GSH量、MDA含量和SOD的活力。

1.3.6 RT-PCR检测IL-1β和TNF-α mRNA表达

IL-1β引物序列(291 bp)：5’-GCT ACC TGT GTC TTT CCC GTG G-3’(上游)，5’-TTG TCG TTG CTT GGT TCT CCT TG-3’(下游)。TNF-α引物序列(413 bp)：5’-’CCC CAA GTG ACA AGC CAG TA -3’(上游)，5’-’CAA AGT CCA GAT TAG GCA GAT -3’(下游)。内参β-actin引物序列(198 bp)：5’ATC GTG CGT GAC ATC AAA GAGA3’(上游)，5’TGC CAC AGG ATT CCA TAC CCAA3’(下游)。操作步骤根据RT-PCR试剂盒说明进行。PCR反应条件设置如下：94℃预变性4 min，94℃变性40 s，退火(IL-β: 58℃ 40 s；TNF-α: 55℃ 40s)，72℃延伸1 min，30个循环。PCR结果采用CT值比较相对定量法，β-actin为内参照。

1.3.7 Western blot检测IL-1β、TNF-α及caspase-3蛋白表达

匀浆后提取总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度。常规电泳，转膜，封闭后加入IL-1β、TNF-α、caspase-3一抗抗体(TNF-α为1 : 600；IL-1β和caspase-3为1 : 800用TBST稀释)，4℃静置过夜，洗膜，加入辣根过氧化物酶标记二抗(1 : 2 500用TBST稀释)，TBST洗膜三次，吸取等量SuperSignal-WestPico超灵敏型检测试剂盒A液、B液，均匀滴于NC膜上进行化学发光胶片显影，用Quantity One(version 4.6)分析软件计算IL-1β、TNF-α及caspase-3蛋白的表达水平。

1.4 统计学方法

数据统计采用SPSS l7.0软件, 实验结果以均数±标准差(x±s)表示，采用单因素方差分析进行组间差异的显著性检验，再用Bonferroni法进行两两比较，检测水准α=0.05。

2 结果 2.1 HE染色

对照组海马组织CA1和CA3区结构正常，锥体细胞排列整齐，形态正常，细胞着色均匀，胞浆呈淡红色，胞核呈蓝色且较清亮。SE组结构明显异常，细胞排列紊乱，神经元肿胀、呈梭形或三角形、有的细胞体积缩小、细胞深染与皱缩、细胞与周围分界不清等神经元坏死改变。大黄素100 mg/kg组仍可见神经细胞排列紊乱，细胞皱缩和胞核固缩浓染，呈梭形或三角形等现象，但程度较SE组略减轻，大黄素200 mg/kg组和400 mg/kg组细胞形态则改善明显。见图 1。

2.2 TUNEL染色

对照组CA3区基本未见棕褐色的阳性颗粒细胞；SE组CA3区，呈棕褐色的TUNEL阳性颗粒细胞显著增加(P < 0.01)。大黄素(200和400 mg/kg)治疗组较SE组CA3区TUNEL阳性细胞明显减少，二者之间的差异有统计学意义(P < 0.05)。100 mg/kg治疗组海马CA3区TUNEL阳性细胞数较SE组有所减少，但二者之间差异无统计学意义(P>0.05)。见图 2和表 1。

2.3 GSH、MDA含量及SOD活力检测

与对照组相比，SE组海马组织GSH含量和SOD活力显著下降，MDA含量则显著增多，差异具有统计学意义(P < 0.01)。与SE组相比，大黄素200 mg/kg治疗组及400 mg/kg治疗组海马组织GSH含量和SOD活力上升明显，MDA含量显著降低，差异具有统计学意义(P < 0.05)；而在大黄素200 mg/kg治疗组与400 mg/kg治疗组之间相比，差异无统计学意义(P>0.05)。与SE组相比，大黄素100 mg/kg治疗组GSH含量和SOD活力有所增加，MDA含量略有降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表 2。

2.4 IL-1β和TNF-α mRNA的表达

各组均有IL-1β和TNF-α mRNA的表达。对各组条带进行光密度分析，可见对照组仅有微弱的IL-1β和TNF-α mRNA表达。SE组IL-1β和TNF-α mRNA表达明显增多。大黄素100 mg/kg治疗组有降低IL-1β和TNF-α mRNA表达的趋势，但与SE组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。大黄素200及400 mg/kg治疗后可明显降低IL-1β和TNF-α mRNA的表达强度，与SE组相比，差异性具有统计学意义(P < 0.05)。而大黄素200 mg/kg治疗组与400 mg/kg治疗组之间相比，差异无统计学意义(P>0.05)。见图 3和表 3。

2.5 IL-1β、TNF-α及caspase-3蛋白的表达

Western blot结果显示，各组均有IL-1β、TNF-α、caspase-3蛋白的表达(图 4)，对各组条带进行光密度分析，可见对照组仅有较微弱的IL-1β、TNF-α、caspase-3蛋白表达，而SE组IL-1β、TNF-α、caspase-3蛋白表达量则显著增加，二者之间差异明显(P < 0.01)。与SE组相比，大黄素200、400 mg/kg组可显著降低IL-1β、TNF-α、caspase-3蛋白的表达量，二者之间差异具有统计学意义(P < 0.05)。200 mg/kg与400mg/kg治疗组相比(P>0.05)，无统计学意义。大黄素100mg/kg治疗组则有下降趋势，但无统计学意义(mg/kg)。(图 4)。

3 讨论

癫痫持续状态(status epilepticus, SE)是严重的神经科急症，其中全面性惊厥性癫痫持续状态具有潜在致死性^[6]。反复癫痫发作可激活神经细胞、神经胶质细胞释放大量的活性氧自由基和炎症介质，如白细胞介素类、干扰素类以及肿瘤坏死因子类等^[7]，造成脑组织再次损伤。TNF-α和IL-1β是两个重要的促炎细胞因子，它们不仅参与癫痫所致的脑内异常免疫炎症反应，还可调节神经元的兴奋性。高水平的细胞因子可导致海马苔藓纤维发芽及硬化，从而加剧癫痫的发作^[8]。我们的研究证实，癫痫发作后海马神经元结构明显异常，细胞排列紊乱，核固缩深染等神经元坏死改变。通过TUNEL染色检测到，癫痫发作后海马神经元有大量凋亡现象出现。为进一步证实癫痫发作后引发神经细胞的凋亡，我们对处于细胞凋亡蛋白酶级联切割途径中核心位置的重要指标—caspase-3进行了检测，癫痫发作后caspase-3含量较对照组显著增加。此外，我们分别对氧自由基GSH、MDA、SOD和炎症介质IL-1β、TNF-α进行了检测，癫痫发作后海马组织GSH含量和SOD活力显著下降，MDA含量则显著增多，IL-1β和TNF-α表达明显增多。说明癫痫发作可激活大量的氧自由基和炎症介质。在高炎症因子和高兴奋性的病理情况下，不仅增加神经元兴奋性、诱导神经细胞凋亡，还可破坏血脑屏障，使外周免疫细胞与炎性物质浸入到大脑，最终导致或加重癫痫，形成恶性循环^[9]。

大黄素为蒽醌类衍生物，具有抗炎、止血、消肿、止痛、抗肿瘤、免疫抑制和改善微循环等作用，临床主要用于治疗便秘、黄疸、消化道出血、颅脑损伤以及癌症等疾病^[10]。最近文献报道大黄素可减轻脑缺血、心肌缺血所致再灌注损伤，能有效抑制脑缺血、心肌缺血后引起的氧化炎性反应，从而降低细胞的坏死与凋亡^{[3, 11]}。此外，研究显示^[12]大黄素还可以减轻谷氨酸-NMDA受体途径对神经元的兴奋毒性作用，即能抑制癫痫发生过程中谷氨酸引起的兴奋性增高，降低癫痫发作阈值。Gu等^[13]发现大黄素可以通过影响Na⁺-K⁺-ATP酶等离子通道的活性减轻脑水肿，升高SOD、Na⁺-K⁺-ATP酶活性，降低MAD水平。Yang等^[14]用海人酸建立大鼠颞叶癫痫模型，经大黄素处理后大鼠表现出癫痫发作级别降低，脑电图提示棘波和尖波等癫痫波发放减少。本实验研究采用海人酸建立小鼠癫痫模型，通过腹腔注射大黄素对其进行干预，发现大黄素(200、400 mg/kg)可显著减轻癫痫所致的海马神经细胞的损伤和凋亡；提高GSH和SOD的活性，降低MDA的活性，从而减轻癫痫发作后所引起的氧化损伤；同时检测到海马组织中IL-1β和TNF-α及caspase-3的表达量下调。大黄素200 mg/kg与400 mg/kg治疗效果无显著差异。由此得出，大黄素(其中以200 mg/kg为最佳治疗浓度)对小鼠癫痫持续状态后海马神经细胞具有神经保护作用。

综上所述，大黄素可减轻癫痫所致的海马神经细胞的损伤和凋亡，提高GSH和SOD的活性，降低MDA的含量，并抑制IL-1β和TNF-α及caspase-3的表达有关。具有抗氧化、抗炎和抗凋亡等神经保护作用，其具体作用途径与详尽机制有待进一步研究。