帕金森病(Parkinson’s Disease, PD)是一种年龄相关的神经退行性病变^[1]，其病理特点为黑质纹状体部位多巴胺神经元特异性的受损、缺失，从而导致多巴胺的分泌减少^[2]。目前对于帕金森的治疗临床仍无有效手段。近年来的研究表明，细胞移植治疗，特别是神经干细胞移植治疗帕金森是目前最具潜力的手段之一^[3]。然而目前的神经干细胞移植治疗帕金森仍面临细胞移植存活率低，向多巴胺神经元分化效率低等困境^[3]。如何促进移植神经干细胞存活以及更高效向多巴胺神经元分化已成为干细胞移植治疗帕金森策略成败的关键。一系列的研究表明，核受体相关因子1(nuclear receptor-related factor 1, Nurr1)作为核受体相关蛋白超家族中的一员，其参与了中脑神经干细胞向多巴胺神经元的分化，与多巴胺神经元的生长、发育以及神经功能的维持密切相关^[4]。同时有研究报道，Nurr1可通过促进神经营养因子分泌参与调控中枢神经系统微环境改变从而影响神经元的存活与发育^[5]。因此，本研究拟通过Transwell系统，共培养同时过表达Nurr1的小胶质细胞与神经干细胞，探讨Nurr1对神经干细胞向多巴胺神经元分化的影响。

1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 动物及主要设备

SPF级新生(SD)大鼠、孕12.5(SD)大鼠(SCXK湘20130004)；细胞培养箱(Thermo)；荧光显微镜(Olympus)；酶标仪(Bio-Tek)；凝胶成像系统(Bio-rad)。

1.1.2 实验材料及试剂

细胞培养耗材(Corning)；细胞培养基(hyclone)；RIPA裂解液(Beyotime)；逆转录试剂盒(Fermentas)；(nestin和TH)Antibody(Proteintech，Source：rabbit)；Alex-Fluor 594-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(Proteintech)；FBS(BI)；二抗Goat Anti-Rabbit IgG(Proteintech)；DAPI(Beyotime)。

1.2 方法 1.2.1 神经干细胞原代培养

取孕12.5~14 d的SD大鼠，处死，消毒，取胚胎，无菌条件下取胚胎中脑腹侧组织，剥除脑膜、血管，预冷培养基中剪碎并吹打混合液，70 μm滤网过滤，1000 rmp/min离心5 min，弃上清，重悬，计数，1×10⁵/ml密度接种细胞培养瓶。37℃、5%CO₂培养箱培养，倒置显微镜每天观察细胞形态，1~2 d半量加液。神经干细胞培养基：DMEM/F12、EGF(1 ng/ml)、bFGF(1 ng/ml)、1%L-谷氨酰胺、1%青-链双抗和2%B27。

1.2.2 小胶质细胞原代培养

取新生1~2 d的SD大鼠，冰冻麻醉，消毒，无菌条件下解剖取脑，剥除脑膜、血管，预冷培养基中剪碎并吹打，70 μm滤网过滤，1000 rmp/min离心5 min，弃上清，接种培养，3~4 d半量换液。10~14 d后纯化鉴定。小胶质细胞培养基：DMEM/F12、10%FBS、1%L-谷氨酰胺和1%青-链双抗。

1.2.3 实验分组

实验分为单独神经干细胞移植组(NSC)、联合移植组(NSC+MG)以及联合转Nurr1基因移植组N(NSC+MG)，这里表示两种细胞共同转Nurr1基因组。

1.2.4 Nurr1基因表达载体构建

取培养5~7 d神经球，通过慢病毒系统过表达带有绿色荧光基因的Nurr1-GFP基因；取纯化后的小胶质细胞，通过慢病毒系统过表达带有红色荧光基因的Nurr1-RTP基因。基因表达载体构建具体方法参考本课题前期研究^{[6, 7]}。

1.2.5 神经干细胞、小胶质细胞以及Nurr1表达载体构建的鉴定

分别取培养的神经干细胞、小胶质细胞以及转染Nurr1基因的神经干细胞和小胶质细胞，PBS清洗，含4%多聚甲醛的磷酸缓冲液(PB)固定20 min，0.1%的PBST(Triton X100 + PBS)透膜15 min，5%的BSA封闭，分别加兔抗Nestin(1 :250)、CD11b/c IgG(1 :100)，4℃孵育过夜，分别与AlexFluor594和AlexFluor488结合的山羊抗兔IgG(1 :100)室温孵育30 min，DAPI(2 μg/ml)避光复染5 min，倒置显微镜下观察并拍照。

1.2.6 CCK-8法检测Nurr1对神经干细胞以及小胶质细胞活性影响

在细胞过表达Nurr1后第1天、第3天和第5天，分别取神经干细胞和小胶质细胞，每孔1×10⁴接种于24孔板。37℃、5% CO₂条件培养1~2 d。严格按照CCK-8试剂盒(DOJINDO)说明操作，490 nm波长，在酶标仪上测各孔OD值，并计算细胞活率。

1.2.7 Transwell共培养神经干细胞和小胶质细胞并用ELISA共培养系统神经营养因子表达变化

取Transwell培养板，培养小室下方，接种神经球(5~7 d)，分化培养基培养，培养小室上方，接种纯化后的小胶质细胞。按照神经干细胞与小胶质细胞3 :1比例每个小室共加入4.5×10⁵个细胞。每3~4 d半量加新鲜培养基。分别在共培养第3天、第6天和第9天。收集细胞培养基，检测培养基神经营养因子的表达量变化。

1.2.8 RT-PCR和Western Blot检测各组细胞培养第9天酪氨酸羟化酶、多巴胺转运蛋白和Nurr1的表达变化

在细胞培养9 d，收集下层分化培养的神经干细胞：①提取神经干细胞总RNA，逆转录成cDNA；设计酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)、多巴胺转运蛋白(dopamine transporter, DAT)和Nurr1基因引物，扩增目的基因，1%琼脂糖凝胶电泳，收集并分析数据。②RAPI裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度并定量，8%凝胶电泳，收集并分析数据。

1.2.9 细胞免疫荧光鉴定神经干细胞分化培养第9天，多巴胺神经元的鉴定以及TH和DAT阳性细胞计数

Transwell共培养系统细胞共培养第9天，收集各组下层分化培养的神经干细胞，PBS清洗，PB固定20 min，0.1%的PBST透膜15 min，5%的BSA封闭，分别加兔抗TH(1 :100)和DAT(1 :100)，4℃孵育过夜，分别与AlexFluor594和AlexFluor488结合的山羊抗兔IgG(1 :100)室温孵育30 min，DAPI(2 μg/ml)避光复染5 min，倒置显微镜下观察并拍照。

2 结果 2.1 小胶质细胞以及神经干细胞的培养以及过表达基因载体的鉴定

混合小胶质细胞培养至第11天，手拍法纯化后，细胞呈梭形，分枝状，部分细胞呈圆形等形态(图 1A1)，细胞免疫荧光鉴定，荧光显微镜下CD11b/c阳性细胞率>95%(图 1A2)。慢病毒过表达系统过表达Nurr1-RTP基因后，细胞表达红色荧光蛋白(图 1A3)。

神经干细胞培养至第5天，细胞聚集呈神经球(图 1B1)，细胞免疫荧光鉴定，神经球Nestin阳性(图 1B2)。慢病毒系统过表达Nurr1-GFP基因后，细胞表达绿色荧光(图 1B3)。细胞核染色为蓝色荧光。

分别在过表达Nurr1基因后第1天、第3天和第5天，CCK-8法检测Nurr1对神经干细胞以及小胶质细胞活性影响，结果表明，过表达Nurr1基因对神经干细胞以及小胶细胞活性无明显影响(图 1C、图 1D)。

2.2 ELISA检测Transwell共培养系统神经营养因子表达变化

分别在共培养第3天、第6天和第9天，收集细胞培养基，ELISA检测结果表明，在细胞培养第3天，N(NSC+MG)组神经营养因子脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(glia cell-line derived neurotrophic factor, GDNF)以及血小板源性神经营养因子(platelet derived neurotrophic factor, PDNF)表达量明显高于其他各组(P < 0.05)，而NSC组与NSC+MG组上述三种神经营养因子表达量无显著差异(图 2A)；细胞培养第6天，N(NSC+MG)组神经营养因子BDNF、PDNF和GDNG表达量明显高于其他各组(P < 0.05)。NSC+MG组PDNF表达量明显高于NSC组(P < 0.05)，而BDNF和GDNF表达变化无显著差异(图 2B)；细胞培养至第9天，N(NSC+MG)组神经营养因子BDNF、PDNF和GDNG表达量明显高于其他各组(P < 0.05)，而NSC+MG组上述三种神经营养因子表达量明显高于NSC组(P < 0.05)(图 2C)。

2.3 RT-PCR和Western Blot检测各组TH、DAT和Nurr1基因表达水平变化

细胞共培养第9天，分别提取分化神经干细胞总RNA和细胞总蛋白，RT-PCR分别检测TH、DAT和Nurr1 mRNA的表达，检测结果表明，N(NSC+MG)BDNF组TH、DAT和Nurr1三种基因mRNA的表达水平明显高于其他各组；NSC+MG组DAT基因mRNA的表达水平明显高于NSC组，而TH和Nurr1的表达水平无显著差异(图 3A1-C1)。Western Blot检测结果表明，TH、DAT和Nurr1蛋白的表达量与RT-PCR检测结果有相同趋势(图 3A2-C2)。

2.4 细胞免疫荧光多巴胺神经元的鉴定以及TH和DAT阳性细胞计数

细胞免疫荧光鉴定神经干细胞分化培养第9天，细胞免疫荧光鉴定结果表明，神经干细胞可分化为TH和DAT阳性细胞(图 4A)；免疫阳性细胞计数结果显示，N(NSC+MG)组TH和DAT细胞阳性率明显高于其他各组，NSC+MG组TH和DAT细胞阳性率明显高于NSC组(图 4 B、图 4C)。

3 讨论

帕金森病(PD)也称震颤麻痹，是仅次于阿兹海默病的第二大神经退行性疾病^[2]。帕金森病的主要病理表现为黑质纹状体多巴胺神经元的特异性减少以及路易(Lewy)小体形成^{[8, 9]}。临床特征主要表现为运动迟缓、静止性震颤以及一些精神认知功能障碍。现在的研究观点认为细胞移植治疗帕金森是目前最具有潜力的手段之一^[10]。关于干细胞移植治疗帕金森研究，虽然目前各研究取得的结果不尽相同，但是神经干细胞作为一种可再生细胞，仍具有巨大的应用潜力^[11]。然而，如何改善干细胞移植后的微环境，使移植后的细胞更易存活，提高其向多巴胺神经元的分化效率已成为影响干细胞移植治疗帕金森效果的关键因素。

Nurr1也称为核受体亚家族4A组第2个成员，主要表达于中脑黑质与腹侧被盖区^[12]。最新的研究结果表明，Nurr1可通过促进神经营养因子的分泌从而发挥神经保护作用^[13]，其作用机制是通过下调CCL2基因表达实现的^[14]。另有研究表明，Nurr1的表达上调可促进神经干细胞的增殖分化，并且可促进多巴胺神经元的成熟，这也为干细胞移植治疗帕金森带来巨大的应用前景^{[15, 16]}。

本研究结果表明，Nurr1基因可在小胶质细胞以及神经干细胞稳定过表达，且过表达Nurr1基因对细胞活性无明显影响。ELISA检测Transwell共培养神经干细胞以及小胶质细胞神经营养因子的结果表明，过表达Nurr1基因可有效促进BDNF、GDNF以及PDNF的分泌。RT-PCR和Western Blot检测结果显示，在共培养第9天，联合过表达Nurr1基因组TH、DAT和Nurr1基因的转录以及表达水平明显高于其他各组，这表明过表达的Nurr1基因在细胞内稳定表达，同时也表明，过表达Nurr1基因组的多巴胺神经元数量明显高于对照组。细胞免疫荧光对TH和DAT阳性细胞计数表明，过表达Nurr1组的TH和DAT阳性细胞计数明显多于其他各组，这与上述结论一致。本研究联合共培养小胶质细胞和神经干细胞，并同时过表达Nurr1基因，一方面可促进小胶质细胞分泌神经营养因子，另一方面可促进神经干细胞的增殖与分化，这两者结合更有利于提高神经干细胞向多巴胺神经元的分化效率。

综上所述，本研究得出以下结论：过表达Nurr1基因可有效促进神经干细胞和小胶质细胞共培养系统神经营养因子的分泌；Nurr1基因可促进神经干细胞向多巴胺神经元的分化；Transwell共培养系统联合培养小胶质细胞与神经干细胞并过表达Nurr基因可显著提高神经干细胞向多巴胺神经元的分化效率。