2018, Vol. 45扩展功能
文章信息
- 王长林, 牛万祥, 程传东, 鲍得俊, 牛朝诗
- WANG Chang-lin, NIU Wan-xiang, CHENG Chuan-dong, BAO De-Jun, NIU Chao-shi
- 雄激素受体抑制剂通过AR信号通路对胶质瘤生物学特性的影响
- Effects of androgen receptor inhibitor (flutamide) on biological characteristics of glioma via the androgen receptor signaling pathway
- 国际神经病学神经外科学杂志, 2018, 45(1): 5-9
- Journal of International Neurology and Neurosurgery, 2018, 45(1): 5-9
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文章历史
收稿日期: 2017-10-20
修回日期: 2018-01-04
2. 脑功能与脑疾病安徽省重点实验室, 安徽 合肥 230001;
3. 安徽省脑立体定向神经外科研究所, 安徽 合肥 230001
胶质瘤是最常见的脑肿瘤，对于高级别胶质瘤来说，肿瘤增殖侵袭性强，复发率高，预后较差。虽然了解胶质瘤的分子机制对于胶质瘤患者的临床治疗极其重要，但目前对于胶质瘤发生、发展的认识依然有限。既往有流行病学调查显示，胶质瘤患者中男性发病率为女性的1.5~2倍[1, 2]，随后的研究发现AR在胶质瘤组织中存在高表达，但确切的机制还不清楚。AR抑制剂(flutamide)为非甾体类抗雄激素药物，主要应用于临床上前列腺癌的治疗。本研究采用AR抑制剂(flutamide)作用于人胶质瘤细胞，观察其对细胞增值、凋亡、侵袭的影响，初步探讨AR在胶质瘤发病机制中的作用。
1 材料与方法 1.1 材料人胶质瘤细胞U251(上海中科院细胞库)；AR抑制剂(flutamide)(Sigma公司)；RNA提取试剂盒RNeasy Mini Kit(德国QIGEN公司)；反转录试剂盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(美国赛默飞公司)；Real Time-PCR试剂盒Premix Ex TaqTMⅡ(Takara公司)；小鼠抗人AR单克隆抗体(Santa Cruz)；Cell Counting Kit-8(日本同仁公司)；Transwell chamber、Matrigel胶(美国Corning公司)；Annexin V-7AAD/PE凋亡试剂盒(BD)；AR和GAPDH引物(Invitrogen)。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养人胶质瘤细胞U251在含有10%的胎牛血清、1%双抗的高糖DMEM培养基中，置于5% CO2、37℃培养箱中培养。
1.2.2 Flutamide处理细胞精确称量0.25g flutamide，加入9ml无水乙醇充分溶解，使其浓度为0.1mol/L母液，4℃存放使用。使用前先用培养基稀释100倍，然后逐步稀释到实验浓度(乙醇终浓度＜0.01%对细胞生长无影响)。取对数生长期的U251细胞，分别加入终浓度为1.0×10-6mol/L、1.0×10-7mol/L、1.0×10-8 mol/L flutamide在培养箱中培养，根据不同实验要求进行细胞处理。
1.2.3 Real Time-PCR检测AR的mRNA表达取flutamide分别处理过的细胞，按照RNeasy Mini Kit方法提取RNA，之后使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒将RNA反转录成cDNA。进行Real Time-PCR反应，反应条件：预变性(95℃，30s)、变性(95℃，5s)、退火延伸(60℃，34s)，40个循环。所有样本设置3个复孔。记录下其Ct值，AR上游引物：5’-CTCTCACATGTGGAAGCTGCAAG-3’，下游引物：5’-TTTCCGAAGACGA CAAGATGGAC-3’；内参GAPDH上游引物：5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游引物5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。
1.2.4 Western Blot检测AR的蛋白表达将flutamide处理过的细胞加入细胞裂解液进行裂解，提取各组蛋白质，然后SDS-PAGE电泳、转膜，5%脱脂牛奶封闭，加入AR-抗孵育，ECL法曝光显影。
1.2.5 CCK-8检测细胞增殖将对数生长期的U251细胞进行消化离心，取3000个/100μl的细胞分别加入96孔板中，细胞贴壁后依次加入低浓度(1.0×10-8 mol/L)、中浓度(1.0×10-7 mol/L)、高浓度(1.0×10-6 mol/L)的flutamide溶液，每组设置3个复孔。24h、48h、72h后分别加入CCK8溶液10μl，置于培养箱中孵育2h, 用酶标仪测得450nm的OD值。
1.2.6 流式检测细胞凋亡分别将不同浓度flutamide处理的胶质瘤细胞消化离心，收集1×106个细胞，用1ml 1×Binding Buffer缓冲液重悬细胞，从中取100μl，分别加入5μl Annexin V-7AAD和5μl PE溶液，混匀后室温避光孵育15min后加入400μl 1×Binding Buffer，用流式细胞仪检测细胞凋亡。
1.2.7 Transwell侵袭实验将flutamide处理过的细胞换成无血清培养基饥饿24h后，进行消化离心，取3×105个/ml的细胞液200μl加入小室内，下室加入700μl的有血清培养基，置于培养箱中培养24h后，依次进行4%多聚甲醛固定、甲醇通透、结晶紫染色，然后显微镜下进行观察。
1.3 统计学分析所有数据使用“(x±s)”表示，根据SPSS 17.0统计软件分析数据，计量资料采取单因素方差分析，P﹤0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 Flutamide在U251细胞中对AR表达的影响RT-qPCR结果显示(图 1)，对照组U251细胞中AR的mRNA相对表达量为1.061±0.053，与对照组相比较，加入低浓度flutamide组为0.929±0.043，中浓度组为0.813±0.031，高浓度组为0.711±0.054，可见随着flutamide药物浓度的增高AR的mRNA表达逐渐降低，差异有统计学意义(F=32.426，P﹤0.05)。
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| 图 1 flutamide抑制U251细胞中AR mRNA的表达水平 |
Western Blot结果显示(图 2)，AR蛋白表达的特异性条带出现在120KDa的位置上，对照组U251细胞中AR蛋白的相对表达量为1.000±0.062，与对照组相比较，加入低浓度flutamide组为0.903±0.041，中浓度组为0.449±0.511，高浓度组为0.338±0.040，可见随着flutamide药物浓度的增高AR的蛋白表达逐渐减少，差异有统计学意义(F=138.007，P﹤0.05)。
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| 图 2 flutamide抑制U251细胞中AR蛋白的表达水平 |
如图 3，随着flutamide药物浓度的增加，细胞在48h、72h时的增殖逐渐被抑制，低浓度flutamide组差异无统计学意义(F=0.573，P=0.592＞0.05)，中浓度组差异有统计学意义(F=15.359，P﹤0.05)，高浓度组差异有统计学意义(F=24.667，P﹤0.05)。
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| 图 3 flutamide抑制U251细胞增殖 |
| 浓度/时间 | 24H | 48H | 72H | ||
| 低浓度组(1×10-8mol/L) | 1.17±1.04 | 1.74±0.44 | 2.70±2.85 | F=0.573 | P＞0.05 |
| 中浓度组(1×10-7mol/L) | 1.52±1.05 | 5.91±2.0 | 10.12±2.40 | F=15.359 | P﹤0.05 |
| 高浓度组(1×10-6mol/L) | 1.12±0.80 | 9.10±0.17 | 18.09±5.06 | F=24.667 | P﹤0.05 |
| F=0.148 | F=29.080 | F=13.500 | |||
| P＞0.05 | P﹤0.05 | P﹤0.05 |
如图 4，正常对照组的细胞凋亡率为4.07%±0.57%，低浓度flutamide组为11.66%±1.65%，中浓度组为16.99%±1.01%，高浓度组为23.31%±0.65%，可见随着flutamide药物浓度的增高细胞凋亡率显著提高，差异有统计学意义(F= 178.662，P﹤0.05)。
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| 图 4 流式细胞仪检测flutamide诱导U251细胞凋亡 A：正常U251细胞凋亡率；B：低浓度flutamide组(1.0×10-8mol/L)作用下细胞凋亡率；C：中浓度flutamide组(1.0×10-7mol/L)作用下细胞凋亡率；D：高浓度flutamide组(1.0×10-6mol/L)作用下细胞凋亡率 |
如图 5，正常对照组的侵袭细胞数为138.04±8.12个/视野，低浓度flutamide组为105.33±3.51个/视野，中浓度组为85.67±6.03个/视野，高浓度组为63.66±3.42个/视野，结果显示随着flutamide药物浓度的增高细胞侵袭能力下降，差异有统计学意义(F=95.506，P﹤0.05)。
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| 图 5 flutamide抑制U251细胞侵袭(200×) A：正常组U251细胞侵袭细胞数；B：低浓度flutamide组(1.0×10-8mol/L)侵袭细胞数；C：中浓度flutamide组(1.0×10-7mol/L)侵袭细胞数；D：高浓度flutamide组(1.0×10-6mol/L)侵袭细胞数 |
AR属于核受体(NR)基因超家族中的成员之一，是激素诱导型DNA结合转录因子[3]。与其他核受体一样，AR激活广泛的编码蛋白和非编码RNAs的靶基因[4]。AR在许多细胞类型中表达，有研究发现AR信号在调节多种肿瘤增殖和凋亡方面有重要作用，包括前列腺癌、膀胱癌、肾癌、肺癌、乳腺癌和肝癌[5]。近几年研究发现，AR在胶质瘤组织中高表达，是引起胶质瘤发生、发展的一个危险因素[6-9]。因此，本实验选择AR抑制剂(flutamide)作用于人胶质瘤细胞系U251，观察其对人胶质瘤细胞增殖凋亡的影响，探讨AR在胶质瘤发病机制中的作用。
Flutamide为非甾体类抗雄激素药物，其主要的活性形式为小羟基flutamide，可以和AR结合，阻断双氢睾酮与AR的结合，导致靶组织对双氢睾酮的摄取阻断，从而起到抗雄激素的作用。在我国，flutamide作为AR的阻断药被广泛应用于临床上前列腺癌的治疗[10]。本实验将不同浓度的flutamide(低浓度1.0×10-8mol/L，中浓度1.0×10-7mol/L，高浓度1.0×10-6mol/L)分别作用于胶质瘤细胞U251，研究发现随着flutamide浓度的提高，胶质瘤细胞U251中AR表达减少，其肿瘤增殖、侵袭能力下降和凋亡增加。
既往研究发现，AR参与了多种信号通路影响肿瘤的进展：①通过基因和非基因转录激活PI3-K/AKT信号通路参与细胞增殖；②与EGF相互关联促进细胞的生长；③与FOXA1/2相互结合调控细胞的增殖与周期；④促进端粒酶活性的表达进而抑制凋亡；⑤AR在IGF、FGF、VEGF、TGF-β和β-actenin等信号通路的调控中也占有重要作用[11-13]。此外，AR也参与到了原癌基因和抑癌基因的调节，激活或抑制下游靶基因的调控进而影响细胞的增殖与凋亡[14]。
目前，替莫唑胺是临床上胶质瘤患者使用最广泛的化疗药，然而其并不能达到满意的治疗效果[15]。所以，临床医生迫切需要研究出胶质瘤治疗的有效靶点。而目前有研究发现胶质瘤患者血清睾酮水平明显高于正常人，且术后患者睾酮水平下降明显，进一步研究发现睾酮合成关键酶CYP17和AR在胶质瘤组织中高表达，且和病理级别相关[6-9, 16]。既往AR的作用在前列腺癌中被广泛研究，因此针对治疗前列腺癌的AR抑制剂也不断被开发。而本研究通过flutamide作用于胶质瘤细胞抑制AR的表达，从而影响了胶质瘤细胞的增殖和凋亡。这说明AR可能是胶质瘤治疗中的一个潜在靶基因。
综上所述，本实验研究发现flutamide在体外可以明显降低胶质瘤细胞的增殖、侵袭能力，同时细胞凋亡增加，表明AR是胶质瘤发生、发展中的关键因素，但其作用机制还需要进一步的研究，为胶质瘤患者的内分泌治疗提供新的思路。
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