阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种神经系统变性疾病，是临床最常见的老年痴呆类型，其主要病理特征是细胞外老年斑(senile plaque, SP)和细胞内神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFTs)的形成。目前全球有超过4680万的患者，预计到2050年患者数将达到1.31亿^[1]。然而目前并没有有效的治疗措施。β淀粉样蛋白(amyloid β-protein, Aβ)的异常聚集是导致AD整个神经病理过程的最初和最关键的步骤，也是免疫治疗的靶点^[2]。

动物实验证实，Aβ主动免疫治疗和被动免疫治疗不仅能够减少脑内Aβ沉积，还能够延缓认知功能的减退。然而，到目前为止，大多数Aβ免疫治疗的临床试验并未如动物实验那样达到预期的疗效^[2]。因此研究者们开始更多的关注一种新型疫苗——DNA疫苗。DNA疫苗是一种安全、有效、高产的疫苗，是需要载体介导、人为编码的DNA片段。设计一个有效的DNA疫苗需要考虑多方面的因素：抗原的选择、载体系统、佐剂、免疫接种途径、剂量、时间和加强免疫剂型等，这些都将影响疫苗诱导免疫应答的强度和性质，从而对免疫的最终结果产生影响。

1 抗原

AβN-末端作为免疫原能够产生强烈的体液免疫反应，避免了有害的Aβ特异性T细胞反应。已有研究证实Aβ的B细胞抗原决定簇位于在1~15区域，是产生抗Aβ抗体的主要表位；Aβ的T细胞抗原决定簇位于16~42区域，是诱导Aβ特异性的T淋巴细胞反应的表位^[3]。因此可以选用Aβ的B细胞抗原决定簇作为AD疫苗免疫原，它不仅对AD的预防及治疗有效，又不诱发炎症反应，而且还可因它不是引起AD的毒性肽，多次应用后无脑内沉积及细胞毒性的危险。Frenkel等^[4]分析了多个N末端片段认为Aβ N端第3~6位氨基酸残基EFRH是影响Aβ可溶性或成纤维的主要表位，缺少3号位氨基酸时其与抗Aβ抗体的亲和性明显降低。于是研究者选用了不同的抗原表位：Aβ_1-5、Aβ_1-8、Aβ_1-9、Aβ_4-10、Aβ_3-7、Aβ_1-10、Aβ_1-6(CAD106)^[5]、Aβ_1-7(ACC-001)^[6]、Aβ_1-11(AV-1955)^[7]、Aβ_3-10^[8]、Aβ_1-14(UB-311)和Aβ_1-15(ACI-24)等，通过抗Aβ抗体的产生、Th1型反应引起的副作用、对实验动物或是患者安全、可耐受、延缓AD进展等方面进行评价。

2 载体

DNA疫苗的载体主要有病毒和质粒。病毒载体作为基因传递工具，有许多优点：基因结构清楚，易于重组改造；感染效率高；某些载体可长期表达目的基因；部分载体尚有靶向性。重组腺伴随病毒(AAV)^[9]、腺病毒^[10]和流感病毒^[11]等被当作病毒载体用于动物实验。但是，病毒DNA疫苗不能避免病毒的感染与转化，因此安全性问题仍是制约病毒载体应用的首要问题。与病毒载体相比，质粒载体DNA疫苗优势突出^[12]：易于大规模生产；操作简单；花费低；不可能有病毒的感染及转化；安全性高；能够诱导有效的免疫应答；不整合到宿主基因组中；也不会引起抗DNA的自身免疫应答。如果有副反应发生、可以通过停止进一步的疫苗接种来控制，因为相比病毒疫苗，质粒载体半衰期要短。质粒DNA编码的Aβ蛋白能够刺激特异性的抗Aβ抗体的产生，诱发B细胞免疫反应并且无T细胞介导的免疫反应的发生^{[2, 8]}。鉴于临床中，AD患者需终生应用疫苗，上述优势对于治疗的选择是非常重要的因素。因此，非病毒质粒载体是目前AD基因疫苗治疗中最好的选择。

3 佐剂

尽管DNA疫苗优势明显，但仍然有投送效率低和免疫原性弱的巨大瓶颈。DNA疫苗佐剂有可能弥补DNA疫苗的不足。霍乱毒素B亚基(CTB)、皂苷类佐剂(QS-21)和脂多糖衍生物类佐剂(LPS)均可被运用于DNA疫苗中，而寡聚核苷酸类佐剂和基因佐剂是DNA疫苗较为有特点的佐剂，其不但可以是单独的佐剂形式，也可能是质粒DNA的组成部分。基因佐剂通常是质粒DNA编码的细胞因子、生长因子、共刺激分子或转录因子基因，与含有抗原基因的DNA共同免疫，使得细胞因子和抗原在体内表达，诱导特异性免疫应答反应，增强免疫应答水平。补体C3d^[13]、补体C3d-p28^[8]、白细胞介素4^[14]、褪黑素^[15]和白细胞介素10^[16]等佐剂的应用，使得Aβ的免疫原性大大地增强，DNA疫苗的有效性也大大地提高。

4 免疫接种途径

选择DNA疫苗免疫接种途径时主要有3个因素需要考虑：一是DNA疫苗对机体细胞的转染效率；二是抗原基因表达水平；三是抗原向免疫系统的呈递能力。目前AD基因疫苗的免疫接种途径主要有以下几种方法：肌肉注射法、粘膜表面涂布法(鼻粘膜免疫法和口服免疫法)、基因枪导入法、皮下注射法和腹腔注射法等。肌肉注射法是目前基因疫苗免疫最常用的方法。这是因为骨骼肌和心肌等横纹肌可以高效摄取和表达外源基因，其中骨骼肌具有免疫接种容量大，注射方便和安全等优点，因此，经常用来进行基因疫苗注射^[8]。鼻粘膜免疫方法，可经鼻脑通道直接入脑，是一种更方便快捷的方式，且主要产生Th2型免疫反应^[17]。Yoshida等^[18]将Aβ42基因与绿色荧光蛋白基因融合入大米中饲养C57BL/6J鼠，血浆抗体滴度升高。基因枪导入法^[19]被认为是质粒DNA疫苗向体内转染最有效的物理方法，并且目前正应用于临床。基因枪导入是一种无针的弹道装置，将质粒DNA包裹的金颗粒呈递到皮肤表皮层，使得动物和人对DNA疫苗产生强烈的免疫应答，以Th2型免疫反应为主。

5 其他

大多研究人员设计的Aβ免疫原有效片段较小，而肽段越小其抗原性越弱，因此，将Aβ免疫原重复多次序列以增加分子重量，减少肽段的降解，以增强抗原的免疫原性。DNA疫苗抗原浓度1.0 μg/μl为可选择的适宜剂量，而探索注射剂量对诱发强烈的免疫应答水平有重要意义。尽管DNA疫苗单次注射就能获得较长时间的免疫应答，但加强注射能明显增强应答水平，部分研究人员选择初次注射后，间隔2周免疫1次，1月后每月加强免疫1次；或是初次注射后，每隔3周免疫1次。所以探索实验的注射间隔和次数有利于获得满意的应答水平。幼龄动物接种DNA疫苗诱发免疫应答的水平强于老年动物。

在AD基因疫苗研究中，学者们已取得了一些进展，但仍然有很多问题亟待解决。AD患者需要更加安全、有效的DNA疫苗，相信在不久的将来一定会有突破性的进展。