脑红蛋白(neuroglobin, Ngb)作为新近发现的一种携氧球蛋白，它广泛表达于脊椎动物的神经细胞内，具有高度的氧亲和力，可逆性地结合氧，对组织细胞的氧代谢、氧利用有重要作用。在脑缺血缺氧、氧化应激、毒物损伤等病理情况下，Ngb的表达均有不同程度的增加，并作为一种内源性神经保护因子增强脑组织对缺血/缺氧损伤的耐受。

1 Ngb的结构与表达

Ngb是Burmester等^[1]在2000年首次发现的存在于神经组织中一种氧结合球蛋白，并且由人类基因组的生物信息学分析证实。结构分析^[2]表明，人类Ngb呈典型的球蛋白折叠，包含151个氨基酸，分子量17 kDa，与肌红蛋白(myoglobin, Mb)和血红蛋白(hemoglobin, Hb)仅具有20%~25%的同源序列。它包含一个单一的非共价键合的原子Ⅸ修复基团，与其他脊椎动物球蛋白不同，Ngb主要与结合两个组氨酸侧链的血红素铁原子六配位。然而，该结构与少量的单组氨酸(五配位)形式平衡，呈现与典型气体血红素配体反应的结构。

Ngb存在于人类和小鼠的中枢神经系统中，特别是代谢活跃、耗氧剧烈的细胞^{[3, 4]}(如视网膜细胞)，且主要(约90%)位于细胞质中，但免疫组织化学染色、酵母双杂交测定和生化研究等证据^[5]均提示Ngb也存在于线粒体。

Ngb是一种高度保守的蛋白质，人类和小鼠中的Ngb只有6%的氨基酸存在差异，其氨基酸替代率比其他脊椎动物球蛋白降低了近4倍^[6]，这表明Ngb功能对于某些类型的组织是至关重要的。

2 Ngb的神经保护作用

Ngb在广泛的病理状态下的神经保护作用已被很多实验研究证实。在培养的皮质神经元中，反义介导的Ngb敲低使得细胞更易于缺氧，并且在氧化应激下神经母细胞瘤细胞的活力降低^[7]。相反，当培养的皮质神经元暴露于氧-葡萄糖剥夺和再氧化(oxygen-glucose deprivation and reoxygenation, OGD/R)诱导的神经元损伤时，轻度降低温度和Ngb的联合治疗显著增加细胞活力^{[8, 9]}，从而证实了Ngb对OGD/R诱导的神经元损伤的保护作用。在细胞培养中，Ngb的过表达保护细胞免受过氧化氢(H₂O₂)毒害^[10]。在亚砷酸钠(NaAsO₂)诱发的神经毒性研究^{[11, 12]}中，应用RNA干扰技术沉默Ngb，导致NaAsO₂诱导的对小脑颗粒神经元的细胞毒性加剧，证实了Ngb在该病理状况下的保护作用。

除上述体外实验外，Ngb的神经保护作用也在体内实验得到了证实。在Ngb转基因小鼠中^[13]，由CMV启动子或鸡β-肌动蛋白启动子驱动的Ngb过表达改善了卒中模型中组织形态和功能缺陷的严重程度。此外，在大鼠局灶性脑缺血模型中^[14]，外源性Ngb和血红素的联合治疗可以显着改善神经行为评分、脑含水量和脑梗死体积；通过基因沉默敲低内源性Ngb的表达则使大鼠局灶性脑缺血的结果恶化。在心脏骤停和复苏的大鼠模型中，Fan等^[15]发现，远端缺血预处理显著降低神经元凋亡和坏死的发生，这与恢复循环24 h后Ngb表达增加相关；而在诱导远端缺血预处理之前给予反义Ngb核苷酸降低Ngb的表达，其神经保护作用也被部分消除。Ngb过表达也可以保护Ngb和淀粉样蛋白前体蛋白(APP)双转基因小鼠的创伤性脑损伤和Aβ诱导的神经毒性和阿尔茨海默病表型^{[16, 17]}。此外，研究视网膜损伤^[18]和缺血的体内实验^[19]表明Ngb过表达可以保护视网膜神经节细胞。

尽管大多数研究表明Ngb具有神经保护作用，但也有报道质疑了Ngb对体内神经元的保护能力。例如，在Ngb无效的小鼠中，缺乏Ngb不影响神经元和生物体的存活率，尽管它改变缺氧诱导的c-FOS和低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)基因表达并调控糖酵解途径相关基因^[20]。虽然不能排除Ngb的先天缺陷可能诱发补偿机制，但这些研究表明，至少在内源性表达水平，Ngb不能防止缺血性损伤，所以有学者^[21]提出Ngb可能是一种应激诱导蛋白，当其高水平表达时，可以保护神经细胞免受伤害刺激。

3 Ngb神经保护作用的可能机制 3.1 Ngb通过调节线粒体功能发挥神经保护作用

Brittain等^[22]和Yu等^[23]提出Ngb表达影响线粒体的相关功能，包括ATP和活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成，从而影响神经细胞存活。Ngb能够稳定线粒体膜电位，Ngb过表达与线粒体DNA损伤减少有关^[19]。亦有研究表明^[23]，Ngb可能参与线粒体动力学。事实上，线粒体是非常活跃的细胞器，发生裂变和融合来交换其所需要物质，并积极转移到需要能量的亚细胞部位。Ngb过表达可以消除缺氧诱导的细胞器聚集，并且Ngb也可能在线粒体转运中发挥作用，改善H₂O₂诱导的肌动蛋白缩合^[24]。上述发现及证据均表明Ngb表达局限于代谢活跃、耗氧的细胞类型，其神经保护作用可能是通过调节线粒体功能来实现的。然而，确切的机制仍在研究之中。

3.2 Ngb通过协助氧扩散发挥神经保护作用

尽管Ngb是一种氧结合蛋白，但由于脑中蛋白质水平低(< 1 μM)，且Ngb具有与氧的高结合速率和低解离速率，其保护作用是促进缺氧期间氧扩散的初始假说受到质疑^[25]。然而，虽然Ngb的生物及物理性质对于氧气运输来说并不是最佳的，但至少在某些组织区域，Ngb实际上却可以发挥这种生理作用，如在视网膜中^[26]。也有学者提出Ngb的氧结合特点可能意味着Ngb在氧感测和能量代谢即ATP产生中具有突出作用，缺氧/再氧化后ATP水平的下降被Ngb过度表达显著改善支持该假设^[27]。

3.3 Ngb通过清除ROS/RNS发挥神经保护作用

使用重组人Ngb的研究证实，该蛋白质可以有效地清除各种活性氧，包括超氧化物阴离子、H₂O₂和羟基自由基^[28]。与一氧化氮(NO)的反应是Ngb与Mb共有的反应，基于这一特点，Ngb在防止NO和活性氮(reactive nitrogen species, RNS)诱导的神经毒性中起到神经保护作用。在缺血再灌注损伤的小鼠模型发现^[29]，Ngb过表达与海马CA1区域的ROS/RNS生成和脂质过氧化作用显著降低有关。Ngb可以通过促进表达NO双加氧酶来消除NO，在NO脱氧反应中，含铁的氧﹣血红素络合物与NO反应形成三氧化铁血红素和硝酸盐。然而，由于Ngb快速的自动氧化并且在体内表达的量相当低，所以需要还原剂或还原酶还原体系来回收亚铁形式，以便有效地消除NO^[29]。尽管作出了相当大的努力，但这种再减少系统从未在体内被确定。Liu和Brittain^[30]的基于Ngb在各种条件下的铁态形式稳态浓度的数学模型研究表明，尽管Ngb自动氧化速度快，但在体内仍可以维持低浓度的Ngb。尽管Ngb与血红素配体的反应特征不限于线粒体的多效性，但可以影响它ATP和ROS/RNS产生方面的功能，并且可能驱动Ngb诱导的神经保护的过程，特别是在Ngb过表达时。

3.4 Ngb通过与Cyt-C等蛋白相互作用发挥神经保护作用

蛋白质-蛋白质相互作用的生物信息学分析表明^[31]，Ngb分子表面上超过80%的氨基酸具有非零倾向性，说明Ngb可以利用许多不同的位点与其他蛋白质相互作用。此外，在STRING数据库^{[31, 32]}中搜索涉及人Ngb的已知和预测的蛋白质-蛋白质相互作用，发现Ngb可能与参与调节凋亡过程的许多蛋白质相互作用，例如细胞色素C(cytochrome C, Cyt-C)、电压依赖阴离子通道(voltage-dependent anion channel, VDAC)和信号转导机制(如G蛋白)。大多数所指示的相互作用由STRING预测为与Ngb结合的直接相互作用。Ngb上的界面残基Glu60和Glu87结合Cyt-C上的残基Lys72和Lys25，它们将Cyt-C与凋亡酶激活因子-1(apoptotic protease activating facter-1, APAF1)，一种关键的凋亡形成蛋白，强制的结合^[33]。然而，到目前为止，这些氨基酸相互作用尚未经过实验验证。

3.5 Ngb通过抑制凋亡发挥神经保护作用

Ngb对ROS的清除作用，以及对NO和RNS诱导的神经毒性的保护作用可以减少细胞内毒性刺激的数量并预防凋亡。此外，Ngb可以通过与VDAC，Gα蛋白和Cyt-C等蛋白质的直接相互作用来调节凋亡过程。Ngb不是简单地抑制凋亡过程，而是重置触发凋亡级联反应所需的细胞损伤水平。许多实验证据提供了Ngb表达水平与多种凋亡标志物之间的相关性。在缺氧条件下，使用TAT PTD-Ngb融合蛋白上调初级皮质神经元中Ngb的水平，降低了胱天蛋白酶-3(caspase-3)和caspase-9的活性^[34]。在经历BH3模拟诱导的细胞凋亡或Aβ毒性的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中也观察到通过Ngb过表达可以抑制caspase-3和caspase-9的活性^{[35, 36]}。

在Lan等^[37]的体内研究中，在脊髓损伤前7天通过腺病毒注射诱导大鼠Ngb过度表达，在脊髓损伤后24 h行组织病理学和生物化学评估，结果显示，与对照大鼠相比，过表达Ngb的动物细胞凋亡明显减少，Cyt-C从线粒体到胞浆的释放和caspase-3的活性同时降低，表明在该动物模型中，Ngb的神经保护作用与线粒体依赖性凋亡途径的抑制有关。

4 结语

Ngb作为一种内源性神经保护因子，通过协助氧的转运、清除自由基、调节线粒体功能、抑制凋亡等多种途径增强了组织对缺血/缺氧性损伤的耐受，进一步明确其涉及的信号通路及相关因子形成的分子信号网络，将为外伤性颅脑损伤^[16]、急性脑血管疾病(缺血性及出血性)、急性心肌缺血、视网膜病变、新生儿窒息及帕金森病和阿尔茨海默病^[17]等神经系统退行性病变的治疗带来新的希望，开启新的航向。