2017, Vol. 44扩展功能
文章信息
- 李玲, 李作孝
- LI Ling, LI Zuo-Xiao
- 托法替尼对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠滤泡调节性T细胞/滤泡辅助性T细胞平衡及CXCL13、转化生长因子-β1表达的影响
- Effects of tofacitinib on T follicular regulatory cell/T follicular helper cell balance and expression of CXCL13 and TGF-β1 in experimental autoimmune encephalomyelitis rats
- 国际神经病学神经外科学杂志, 2017, 44(6): 577-581
- Journal of International Neurology and Neurosurgery, 2017, 44(6): 577-581
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文章历史
收稿日期: 2017-05-08
修回日期: 2017-11-14
多发性硬化(multiple sclerosis, MS)是中枢神经系统(central nervous system, CNS)的自身免疫性疾病，本病以白质炎性脱髓鞘为特点[1]，好发于青壮年女性，且复发率和致残率高。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis, EAE)是公认研究MS的理想动物模型。托法替尼(tofacitinib)是一种作用于两面神激酶(Janus Kinase，JAK)的新型小分子口服抑制剂，早期用于类风湿性关节炎的治疗[2]，有研究显示其对银屑病、炎症性肠病、肾移植排斥反应等多种免疫性疾病也取得了较好的疗效[3-5]。Zhou等[6]近期研究发现，托法替尼可诱导产生耐受性树突状细胞(tolerogenic DCs, tolDCs)，进而通过干扰Th17/Treg平衡来改善EAE病情的进展。但目前国内外还未见托法替尼通过影响滤泡调节性T细胞(follicular regulatory T cell, Tfr)/滤泡辅助性T细胞(T follicularhelper cell, Tfh)平衡来防治EAE/MS的报道，因此，本研究通过探讨托法替尼对EAE大鼠Tfr/Tfh平衡及相关细胞因子的影响，期望为MS的治疗提供新的理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物选用SPF级6~8周龄、体质量200~250 g Wistar雌性大鼠50只及体质量250~300g健康豚鼠10只，均购自我院实验动物中心，动物使用许可证：SYXK(川)2013-181。实验前在我院动物房适应性饲养7 d，保持动物房清洁适宜的温度和湿度。
1.1.2 实验药品及试剂托法替尼(Pfizer，美国)；百日咳毒素(上海雅吉生物科技有限公司，中国)；完全弗氏佐剂(Sigma，美国)；Anti-Mouse CD4-FITC、Foxp3-PE、CXCR5-APC、ICOS-PE-CY5(上海嵘崴实业有限公司，中国)；CXCL13 ELISA试剂盒、TGF-β1 ELISA试剂盒(上海桥社生物科技有限公司，中国)。
1.2 方法 1.2.1 EAE模型制作将50只Wistar雌性大鼠随机分为正常对照组、EAE对照组及托法替尼小、中、大剂量防治组，每组10只。EAE对照组及托法替尼小、中、大剂量防治组大鼠双侧后肢足掌皮下注入髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein, MBP)与完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant, CFA)(0.2 ml/100 g)建立模型，正常对照组按同等剂量注入无菌生理盐水与CFA。建模后当天及第2天，将百日咳素(pertussis toxin, PTX)注入各组大鼠腹腔，每只0.2 ml，加强免疫反应。
1.2.2 模型干预托法替尼小、中、大剂量组自造模前3 d开始连续10 d分别按体重灌胃托法替尼1、2、4 mg /kg/d，正常对照组和EAE对照组均灌胃等量生理盐水。
1.2.3 动物模型评价由同一人自建模后每天上午定时(9: 00)评判大鼠临床表现及神经功能障碍评分。评分标准：0分：无临床症状；1分：尾部瘫痪拖地，轻度后肢无力；2分：中度单后肢或双后肢无力；3分：重度双后肢无力；4分：四肢全瘫、尿便失禁；5分：抽搐、濒死或死亡。
1.2.4 实验终止在发病高峰期(症状评分连续3 d无加重、四肢全瘫或死亡)处死大鼠，未发病大鼠饲养8周后处死。
1.2.5 脾脏Tfh细胞及Tfr细胞比例测定实验终止时取大鼠脾脏制作脾细胞悬液，采用流式细胞仪测定脾细胞悬液Tfh细胞及Tfr细胞比例，按说明书操作进行。
1.2.6 脑组织匀浆CXCL13、TGF-β1含量测定采用双抗体夹心(ABC-ELISA)法(按说明书操作进行)对脑组织匀浆CXCL13、TGF-β1含量进行测定。
1.3 统计学方法采用SPSS 20.0统计软件包完成统计分析，计量资料结果均数±标准差(x±s)表示，两组间样本均数比较采用t检验。当方差齐时，多组计量资料均数比较用单因素方差分析(one-way ANOVA)，当方差不齐时用H检验(Kruskal-Wallis)，变量间相互关系采用Pearson直线相关分析。检验水准为双侧α=0.05，P＜0.05表示差异存在统计学意义。
2 结果 2.1 EAE对照组及托法替尼各防治组大鼠发病情况正常对照组未发病。EAE对照组大鼠均不同程度发病，托法替尼各防治组大鼠部分发病，发病大鼠多于造模后10~12 d开始出现精神萎靡、体重减轻、活动及食量减少等，此后病情逐渐加重，造模后15~20 d达疾病高峰(衰弱、消瘦、单后肢或双后肢无力拖地、共济失调、瘫痪甚至死亡)。EAE对照组及托法替尼各防治组大鼠发病潜伏期、进展期和高峰期神经功能障碍评分结果见表 1。
| 组别 | 例数(n) | 潜伏期(d) | 进展期(d) | 神经功能障碍评分 |
| EAE对照组 | 10 | 10.20±1.99 | 10.50±1.84 | 3.80±1.03 |
| 小剂量托法替尼防治组 | 10 | 16.70±1.50a | 8.00±2.00a | 2.30±1.34a |
| 中剂量托法替尼防治组 | 10 | 20.20±2.44ab | 5.60±1.51ab | 1.20±1.40ac |
| 大剂量托法替尼防治组 | 10 | 22.90±1.79abd | 3.00±1.16abd | 0.60±0.84abe |
| 注：a为与EAE对照组相比较，P＜0.01；b为发病潜伏期和进展期与小剂量托法替尼组相比较，P＜0.01；c为发病高峰期神经功能障碍评分与小剂量托法替尼组相比较，P＜0.05；d为发病潜伏期和进展期与中剂量托法替尼组相比较，P＜0.01；e为发病高峰期神经功能障碍评分与中剂量托法替尼组相比较，P＞0.05。 | ||||
EAE对照组与正常对照组比较，Tfh%显著升高，Tfr%及Tfr/ Tfh比值显著降低(P＜0.01; P＜0.05)。而托法替尼各剂量组较EAE对照组Tfh%明显降低，Tfr%及Tfr/ Tfh比值明显升高(P＜0.01; P＜0.05)。见表 2。
| 组别 | 例数(n) | Tfh(%) | Tfr(%) | Tfr/Tfh |
| 正常对照组 | 10 | 3.03±0.62 | 7.07±1.01 | 2.23±0.39 |
| EAE对照组 | 10 | 8.86±0.57a | 2.13±0.91a | 0.23±0.09a |
| 小剂量托法替尼防治组 | 10 | 7.42±0.61ac | 4.23±0.77ac | 0.57±0.06ac |
| 中剂量托法替尼防治组 | 10 | 6.49±1.05ace | 5.05±0.63acd | 0.78±0.05ac |
| 大剂量托法替尼防治组 | 10 | 5.48±1.06acdf | 6.14±0.89bcdg | 1.13±0.10acdf |
| 注：a为与正常对照组相比较，P＜0.01；b为与正常对照组相比较，P＜0.05；c为与EAE对照组相比较，P＜0.01；d为与小剂量托法替尼组相比较，P＜0.01；e为与小剂量托法替尼组相比较，P＜0.05；f为与中剂量托法替尼组相比较，P＜0.01；g为与中剂量托法替尼组相比较，P＜0.05。 | ||||
EAE对照组与正常对照组比较，CXCL13含量明显增加，TGF-β1含量明显减少(P＜0.01)，而托法替尼各剂量组较EAE对照组CXCL13含量明显降低，TGF-β1含量明显升高(P＜0.01; P＜0.05)。见表 3。
| 组别 | 例数(n) | CXCL13(ng/ml) | TGF-1(ng/ml) |
| 正常对照组 | 10 | 5.84±0.78 | 85.60±8.14 |
| EAE对照组 | 10 | 9.03±0.35a | 42.70±5.13a |
| 小剂量托法替尼防治组 | 10 | 8.31±0.49ab | 49.15±6.01ab |
| 中剂量托法替尼防治组 | 10 | 7.54±0.70acd | 59.79±6.33ace |
| 大剂量托法替尼防治组 | 10 | 6.79±0.81acef | 68.68±7.03aceg |
| 注：a为与正常对照组相比较，P＜0.01；b为与EAE对照组相比较，P＜0.05；c为与EAE对照组相比较，P＜0.01；d为与小剂量托法替尼组相比较，P＜0.05；e为与小剂量托法替尼组相比较，P＜0.01；f为与中剂量托法替尼组相比较，P＜0.05；g为与中剂量托法替尼组相比较，P＜0.01。 | |||
MS是一种以CNS炎性脱髓鞘为特点的自身免疫性疾病。MS的发病机制迄今尚不明了，细胞免疫被认为是MS发病的主要机制，而近期研究发现B细胞介导的体液免疫也可促进MS的发展。Tfh是Schaerli等[7]和Breitfeld等[8]在人扁桃体中发现的以CD4+CXCR5+为表型的T细胞亚群，Tfh可辅助B细胞活化、增殖和分化，并形成生发中心，产生高亲和力抗体，参与体液免疫反应[9]。Tfh细胞数量增加及功能增强在多发性硬化、类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的发病机制中起到重要作用[10]。另外，Tfr是在人类扁桃体中新发现的一类调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)亚群，能够高分泌Treg标志性分子(Foxp3、CD25、TGF-1和IL-10等)，抑制Tfh细胞介导的免疫反应，发挥免疫调节作用[11, 12]。Dhaeze等[13]研究发现，MS患者体内Tfr数量较正常对照组明显减少，支持Tfr与MS发病有关。本研究发现，与正常对照组相比，EAE对照组大鼠发病高峰期脾组织中Tfh细胞比例升高，Tfr细胞比例及Tfr/Tfh比值均降低。表明在本实验中EAE大鼠脾脏Tfh细胞比例升高、Tfr细胞比例降低、Tfr/Tfh比值失衡可能参与了EAE的发病过程。
CXCL-13由Tfh细胞、树突状细胞和吞噬细胞合成[14]。当机体免疫应答异常时，树突状细胞、Tfh细胞数量及活性上调，过表达CXCL-13，后者可与Tfh细胞表面CXCR5结合，趋化Tfh细胞至淋巴滤泡内，辅助B细胞活化、产生抗体，诱导异常体液免疫反应。已有研究表明，CXCL-13的异常表达与多发性硬化及其严重程度正相关[15]。TGF-1是Tfr细胞发挥免疫抑制作用的关键因子之一。2014年，McCarron等[16]研究发现，TGF-1能够抑制Tfh细胞的聚积、自身反应性B细胞的激活及自身抗体的产生，进而抑制体液免疫反应。Feger等[17]研究发现，在复发﹣缓解型MS患者急性期TGF-1表达下降、症状加重而缓解期表达升高、症状缓解。本研究发现，与正常对照组相比，EAE对照组大鼠发病高峰期脑组织匀浆中CXCL-13含量增加，TGF-1含量减少。表明在本实验中EAE大鼠脑组织中CXCL-13含量增加，TGF-1含量减少可能参与了EAE的发病过程。
托法替尼是JAK抑制剂，其通过抑制JAK磷酸化，阻断细胞内JAK-STAT信号转导通路，抑制CD4+ T细胞增殖及多种炎性细胞因子(IL-2、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-15和IL-21等)的合成与分泌，达到抗炎、调节免疫的作用。Zhou等[6]研究发现，托法替尼可通过产生耐受性树突状细胞(tolerogenic DCs, tolDCs)、下调Th1/Th17细胞比例、上调Treg细胞比例以调节Th17/Treg平衡来延缓EAE病情的进展，并且Benveniste等[18]提出托法替尼有望成为MS新的有效治疗方式。本研究发现，与EAE对照组相比，托法替尼各防治组大鼠发病潜伏期延长、进展期缩短、高峰期神经功能障碍评分降低，且呈剂量依赖关系，提示托法替尼对EAE发病具有防治作用。同时本研究发现，与EAE对照组相比，托法替尼各防治组大鼠发病高峰期Tfh细胞比例、CXCL-13含量降低，而Tfr细胞比例、Tfr/Tfh比值及TGF-1含量升高，提示托法替尼可通过下调Tfh细胞比例及CXCL-13水平、上调Tfr细胞比例及TGF-1水平、维持Tfr/Tfh平衡并促使平衡向Tfr偏移而发挥对EAE的防治作用。
综上所述，托法替尼可能通过调节Tfr/Tfh平衡及CXCL-13、TGF-1因子表达发挥对EAE大鼠的防治作用。相信随着研究的不断深入，有望将托法替尼作为MS治疗新的靶向药物。
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