从德国细菌学家欧利希于1885年发现一个将中枢神经系统和周围组织器官隔开的结构到莱万多夫斯基于1900年将此结构正式命名为“血脑屏障”开始，人们对血脑屏障的研究从未停止，并构建了愈加接近在体状态的体外模型，为中枢神经系统疾病的发生发展过程及治疗提供了理论依据。如研究发现，当血脑屏障处于病理状态时，其通透性增加促进多发性性硬化和阿尔兹海默病等神经系统疾病发生^[1]，总之，其功能失调终将导致中枢神经系统功能障碍^[2]，阐明血脑屏障的结构组成及功能并建立有效的体外模型有助于推进相关疾病的治疗进程。

1 血脑屏障的组成

内层为脑微血管内皮细胞及其之间的紧密连接，中间为基膜和周细胞, 外层为星形胶质细胞和外基质。微血管内皮细胞及紧密连接是血脑屏障的基本结构^{[3, 4]}。

1.1 脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cell，BMVEC)

脑微血管内皮细胞是位于脑血管内腔膜表面的单层扁平细胞，具有复杂的紧密连接和丰富的线粒体，但缺少跨膜转运的质膜小泡(plasma vesicle)和细胞孔，胞膜上含有多种特殊蛋白，如碱性磷酸酶、γ-谷氨酸转肽酶、精转蛋白、转铁蛋白受体等，细胞质有均匀的厚度，无窗，胞饮活力强。与其直接接触的星形胶质细胞和周细胞保持着血脑屏障的致密性^[5]。脑微血管内皮细胞调控血液和脑实质间物质交换，不仅感知血液中的炎性因子、微循环中激素水平、血流压力变化等信息，还针对这些信息分泌多种活性物质产生调节反应^[6]。由脑微血管内皮细胞形成的内皮细胞层, 严格控制着小分子通道^[7]，将脑组织与血液隔开^[8]，限制药物和外源性物质进入大脑，内皮细胞层独有的受体模式和运输系统不仅促进重要营养素和激素的摄取^[9]，还通过活化泵调节脑内的离子浓度、代谢产物和外源物质^[10]。

脑微血管内皮细胞不仅作为天然物理屏障阻碍有害物质，还能产生和释放保护性物质，阻止脑组织进一步受损。如研究发现，当脑组织受到创伤时，脑微血管内皮细胞miR-21-5p表达量明显增加，miR-21-5p能抑制炎症和细胞凋亡、影响NF-kB和Akt的活动及控制Ang-1 / Tie-2信号通路，起到减轻内皮细胞损伤、抑制内皮细胞间紧密连接蛋白减少、保护血脑屏障的作用^[11]。

1.2 星形胶质细胞

星形胶质细胞与微血管内皮细胞紧密连接, 自身及其产生的活性物质与血脑屏障其它细胞或分子相互作用，促进蛋白聚糖合成，诱导血脑屏障功能^[12]。如其产生的血管内皮生长因子受体能高效调节脑微血管内皮细胞功能，改变血脑屏障通透性^[13]，与星形胶质细胞密切相关Wnt/hedgehog信号通路调控血脑屏障形成和紧密连接完整性，维持血脑屏障的正常功能^[14]。

1.3 周细胞

周细胞亦称血管平滑肌细胞、腔壁细胞、肌成纤维细胞，是毛细血管收缩的承担者，参与脑部止血和自我调节，具有收缩、免疫、迁移及干细胞潜能等功能。主要定植于微血管基膜周边，通过紧密连接和内皮细胞相连，并与内皮细胞共用基膜，周围覆盖22%~32%的微血管，通过调控微循环参与完整血脑屏障的维持或生理病理条件下微血管的再生作用。周细胞能特异性下调内皮细胞膜穿孔和渗透性相关基因的表达，调控蛋白编码以诱导星形胶质细胞终足极化，增强其与内皮接触^[15]。干细胞潜能促使其分化成内皮细胞和胶质细胞，并促进内皮细胞紧密连接形成，维持血脑屏障的稳定性^[16]。此外，周细胞可以调节某些miRNA、长链非编码RNA而影响血脑屏障功能^[17]，有报道称周细胞还参与构成肿瘤间质，形成癌细胞增殖的微环境，可能成为某些癌症的治疗靶点。

2 血脑屏障的其它结构 2.1 基底膜

基底膜是脑微血管内皮细胞外由Ⅳ型胶原、层连蛋白、内肌动蛋白、纤维连接蛋白以及一些精蛋白等组成的一层连续性膜结构。星形胶质细胞、周细胞亦参与构成基底膜^[18]。因其由血管基底膜与神经上皮基底膜融合而比其他部位的基底膜厚。基底膜的破坏必将影响内皮细胞间紧密连接蛋白的表达，造成血脑屏障通透性增加^[19]。

2.2 紧密连接

主要由跨膜蛋白、胞质附着蛋白和细胞骨架蛋白组成。跨膜蛋白由咬合蛋白(Occludin)、闭合蛋白(Claudin)和连接黏附分子(Junctional adhesive molecule, JAM)三种膜蛋白组成；胞质附着蛋白由三种闭合小环蛋白组成，属于膜结合鸟苷酸环化酶激活蛋白家族；最重要的细胞骨架蛋白是纤维状肌动蛋白F-actin。

有研究发现Claudin缺失不仅影响紧密连接构成，还使大鼠出现复杂表型和产后生长迟缓以及胃上皮细胞增生、大脑中出现钙化物质、睾丸萎缩等现象，提示Claudin可能承担了其它重要生理作用，其潜在作用有待进一步探究。Claudin异常可作为某些疾病的致病机制，如癫痫发病时的血脑屏障损伤和脑水肿即因Claudin-8特异性下调导致；艾滋病患者体内Claudin-5缺乏会加速HIV-1进入脑组织。连接粘附分子(JAM)作为一类免疫球蛋白(Ig)，能引起动脉压上升，维持血脑屏障的正常压力和致密性，并与白细胞相互作用影响中枢神经系统的免疫功能。肌动蛋白是重要细胞骨架蛋白，其多聚体形成纤维状肌动蛋白(F-actin)，缺氧缺血所致的血脑屏障通透性改变可能与F-actin重排有关。血脑屏障调控着血液与大脑之间的物质运输, 其异常引起异常血管生成、血管老化、脑灌注不足和炎症反应, 启动“恶性循环”, 导致如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症等众多突触和神经细胞缺失和功能障碍的疾病^[20]。

3 血脑屏障体外模型的构建

一个理想的体外模型应该具备表达多种功能性转运体、限制物质通过等体内血脑屏障生理功能以及同体内一致的细胞形态和生理结构分布。建立可靠且科学的体外血脑屏障必须使各个结构发挥其功能。建立体外模型是重要的研究手段，便于我们深入研究血脑屏障病理生理状态和多种相关疾病。自从脑微血管内皮细胞首次在体外分离并培养成功以来，体外模型得到不断发展和完善^[21]。

3.1 单脑微血管内皮细胞模型

单独培养作为核心成员的脑微血管内皮细胞，构建的体外模型基本可以模拟血脑屏障功能。此模型具有脑微血管内皮细胞存活时间长和细胞间联系紧密的优点，但易出现如特异性抗原表达减弱、紧密连接通透性增高的缺陷，且上述问题会因为细胞核传代出现更复杂的情况。所使用的脑微血管内皮细胞多为原始内皮细胞和永生内皮细胞，永生内皮细胞在跨细胞电阻和促进有关蛋白分子表达方面可能优于原始内皮细胞，但其缺乏重要的屏障功能。迄今为止，hCMEC/D3和bEnd.3细胞系是参与构建体外模型的36种永生内皮细胞系中最适用的两种^[22]。内皮细胞模型大致构建步骤为：分离获取大鼠脑血管内皮细胞；准备神经胶质培养层；将内皮细胞移入细胞培养环境；测跨内皮细胞电阻；通过LY染色或FITC标记右旋糖酐测内皮细胞的渗透性；运用蛋白免疫印迹法测claudin-5含量；质谱分析法测小分子通透性^[23]。

3.2 微血管内皮细胞+星形胶质细胞模型

此模型更完整，更接近在体血脑屏障，体现微血管内皮细胞所具有的屏障功能，较少受到其它生理因素的干扰，被广泛应用于如药理学之类的研究，是目前应用最广泛的模型。大致过程为：取出生后1~3 d的SD大鼠乳鼠，经过匀浆、离心、酶解等步骤分别获得内皮细胞和星形胶质细胞，内皮细胞融合90%传代；建立共培养模型：星形胶质细胞达到70%融合后，接种内皮细胞；内皮细胞和星形胶质细胞的免疫组织化学染色；测定跨内皮细胞电阻(TEER值)^[24]。有研究报道利用造血干细胞构建出具有人血脑屏障功能的体外模型，经星形胶质细胞诱导的造血干细胞分化为内皮细胞，大致过程为：分化分离出脐带血中CD34阳性造血干细胞，诱导其分化为内皮细胞；星形胶质细胞共培养，获得类脑微血管内皮细胞；测量内皮细胞通透性；检测Wnt信号通路；分析脑血管内皮细胞表达的紧密连接蛋白；透射电子显微镜观察单细胞层超微结构^[25]。脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞共培养构建的体外模型最多，通过表面液体泄漏试验、测量TEER、检测γ-GT和ALP含量探究模型有效性^[26]。

3.3 脑微血管内皮细胞+星形胶质细胞+周细胞模型

原代培养的脑微血管内皮细胞与周细胞、星形胶质细胞共培养所反映的细胞间移动及动态相互作用可较好模拟在体状态。通过细胞形态学和免疫细胞化学染色方法鉴定原代培养的细胞，测量跨内皮电阻值、荧光素钠通透性、碱性磷酸酶和γ-谷氨酰转肽酶的表达以及阳性药在体内和体外BBB通透性的相似度评价屏障功能^[27]。有研究利用中空脑微血管共培养原代脑血管内皮细胞和从人体分离的星形胶质细胞及周细胞建立了一个3D微流体模型，可已进一步探究星形胶质细胞和周细胞功能^[28]。

3.4 原代培养脑微血管内皮细胞+周细胞

原代分离、纯化培养大鼠脑血管内皮细胞和周细胞，通过免疫细胞化学染色方法鉴定分离的细胞，应用Transwell插槽(孔径0.4um)共培养构建体外BBB模型，经4h渗漏试验、紧密连接蛋白鉴定、跨内皮电阻检测以及通透性评价屏障功能。此模型缺少星形胶质细胞的功能支持，较少使用。

4 小结

血脑屏障通过调节离子含量为神经元信号传递营造合适的微环境，限制神经兴奋性氨基酸和白蛋白等大分子蛋白进入脑组织，阻止内源性或外源性神经兴奋物质入脑^[29], 亦排除和阻止潜在危害性的物质通过，微血管内皮细胞膜内外的特殊转运系统允许和促进必需营养物质进入脑组织，血脑屏障因此被称为选择性转运屏障；血脑屏障细胞内外的酶类如乙酰胆碱酯酶、碱性磷酸酶等可以促进肽类及ATP代谢，灭活神经刺激性及毒性物质^[30]，血脑屏障因此亦被称为代谢屏障。血脑屏障体外模型为中枢神经系统在生理、病理、生物化学、分子生物学、药理等领域的研究提供了重要研究手段，有效地保持了在体血脑屏障的物质基础，并人为控制实验条件，观察血脑屏障的改变，为人类探究相关神经系统疾病的病因和发病机制提供重要的技术支持。构建更加高效的血脑屏障模型有助于多种疾病的临床研究和治疗。