Duchenne型肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy, DMD)一种罕见的全身肌肉进行性消耗和运动功能减退的X染色体隐性致死性遗传性肌肉疾病^[1]。其临床特点为进行性肌无力和肌萎缩伴小腿腓肠肌假性肥大，病理表现为线粒体肿胀及受损、蛋白质聚集物、肌浆网膨胀等。DMD的发病机制尚未明确，目前该疾病无法完全治愈。

自噬是一种存在于真核细胞中的“自我消化”过程，能抵御病原体的入侵，并对延缓衰老和延长寿命等均具有积极作用^[2]。当自噬被干扰，可导致异常蛋白质和细胞器的聚集，影响正常细胞生长，诱发多种急慢性疾病。微管结合蛋白轻链3(microtubule-associated protein I light chain 3, LC3) 是哺乳动物常见的自噬小体标记物，其参与了自噬的形成^[3]。胞浆型LC3(即LC3-Ⅰ)转化为膜型的LC3-Ⅱ，从而启动自噬。LC3-Ⅱ能调控自噬小体的形成，因此，其含量在某种程度上能反映细胞自噬活性。p62是哺乳动物选择性自噬的底物及调节蛋白，它与LC3相互作用，在自噬体形成和降解过程中起重要作用^[4]。

近年来有学者发现自噬功能障碍参与了DMD表型的mdx小鼠肌细胞坏死进程，从而提出调节自噬有望成为一种新的药物靶点用来治疗DMD^[5]。然而，迄今为止尚无关于DMD患者骨骼肌中自噬表达的相关研究。本研究采用半定量Western blot检测LC3和p62在DMD患者骨骼肌细胞中的表达，判断自噬功能与DMD患者骨骼肌细胞的坏死的关系，为研究调节自噬功能作为新的DMD治疗策略奠定基础。

1 研究对象与方法 1.1 研究对象

入选2008年1月~2015年5月在中南大学湘雅医院神经内科病理确诊DMD患者81例，对照组为同时期就诊怀疑肌病，病理学检查未见明显异常者6例。所有入选者均进行了肌电图、血清心肌酶学检查、骨骼肌活检、常规酶组织化学染色、dystrophin蛋白及dysferlin蛋白免疫组织化学染色检查。

1.2 研究方法 1.2.1 常规酶组织化学染色

所有参与者均进行肱二头肌肌肉活检术。离体新鲜骨骼肌标本快速制成冰冻标本。将DMD组和对照组的冷冻骨骼肌标本进行连续8 μm的冰冻切片，行标准化NADH-TR染色、苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosin staining, HE)、细胞色素C氧化酶染色、改良Gomori三原色染色、琥珀酸脱氢酶染色、酸性磷酸酶染色、ATPase染色、油红O染色及过碘酸雪夫染色。

1.2.2 免疫组织化学染色

将前述切好的8 μm的冰冻切片自然晾干后进行免疫组化染色(ABC法)。切片浸入-20℃丙酮溶液10 min，0.01 M PBS漂洗3次；4℃甲醇/0.3%双氧水(H₂O₂)漂洗30 min；0.01 M PBS再次漂洗3次；0.05体积分数的小牛血清/0.01 M PBS行背景封闭(37℃，15 min)；Ⅰ抗(抗Dystrophin-N, -C, -R抗体1 :50或抗dysferlin抗体1 :50)4℃置48 h；0.01 M PBS漂洗3次；Ⅱ抗(1 :200) 37℃置1.5 h；0.01 M PBS漂洗3次；AB复合物(1 :100) 37℃置1.5 h；0.01 M PBS漂洗3次；Tris-HCL缓冲液37℃孵育15 min；DAB显色5 min；蒸馏水漂洗。自来水冲洗充分后，苏木素轻度复染，用梯度乙醇脱水和二甲苯脱水、透明，最后中性树脂胶封片

1.2.3 蛋白提取及Western blot

随机挑选6例DMD及6例对照组骨骼肌组织0.05 g加入300 μl RIPA裂解液于匀浆器中反复研磨后置冰上裂解30 min，随后4℃，12000 rpm离心15 min，留取上清，-80℃保存。BCA蛋白定量试剂盒(Sigma, USA)进行蛋白浓度测定。取蛋白样本50 μg/孔，加入5X SDS-PAGE上样缓冲液，调整最终上样体积为10 μl，煮沸10 min后进行SDS-PAGE电泳，转膜，10%BSA溶液封闭，加入稀释好的抗体工作液，4℃过夜孵育，TBST洗膜3次。再加入HRP标记的抗人IgG二抗，TBST洗膜3次后，加上化学发光底物，于暗室内压片、曝光、显影和定影。

1.3 统计学分析

运用SPSS 19.0进行统计学分析，计量资料用均数±标准差(x±s)表示，临床资料组间比较采用Mann-Whitney U检验，半定量Western blot组间比较采用t检验。当P < 0.05时为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 一般资料分析

DMD组在年龄、性别与对照组无明显统计学差异(P>0.05)；但DMD组分别有3.7%、14.8%和7.4%患者有早产史、缺氧史和阳性家族史，而对照组均无相关个人史。见表 1。

2.2 临床资料

DMD患者首发症状表现多以双下肢起病为主，其中双下肢无力51例(62.96%)，四肢无力3例(3.70%)。另以发现转氨酶升高为主诉者9例(11.11%)，肌酶升高为主诉者3例(3.70%)。78例患者有不同程度的腓肠肌肥大坚韧、翼状肩胛、“鸭步”步态和Gower征阳性(96.29%)。39例患者出现程度不同的肌萎缩(48.15%)，以肢体近端萎缩多见。

对照组首发症状表现为双上眼睑下垂3例，四肢乏力2例，肝功能异常1例。所有对照组患者均无肌萎缩、腓肠肌肥大坚韧、翼状肩胛、步态异常、Gower征及病理征。6例对照组患者肌电图检查提示无异常者1例，肌源性损害2例，类肌源性损害3例。

2.3 血清肌酸激酶水平检测

81例DMD患者血清肌酸激酶(creatine kinase, CK)均显著升高，位于5547~26589 U/L之间(正常值：24~190 U/L)。DMD患者血清CK值在发病初期随病程增加呈上升趋势，持续约3~4年，随后呈整体下降趋势。对照组中除1例患者CK值轻度升高(205.5 U/L)外，余5例CK值均在正常范围。见图 1。

2.4 常规酶组织化学染色

81例DMD患者骨骼肌活检均呈慢性肌营养不良改变。光镜下HE染色见大量萎缩肌纤维，变性、坏死和再生肌纤维，以及炎性细胞浸润(图 2A和图 2B)。ATPase染色可见呈镶嵌式分布的两型肌纤维，无同型肌纤维群化现象。细胞色素C氧化酶染色、NADH脱氢酶(图 3A和图 3B)和琥珀酸脱氢酶染色均可见部分肌纤维酶活性局限性增高或减低。12例油红O染色可见部分肌纤维内脂滴增多。酸性磷酸酶染色可见其中57例在炎性细胞浸润区和肌细胞变性及坏死区可见酶活性增高(图 3A和图 3B)，24例未见明显异常。Gomori染色及过碘酸雪夫染色未见明显异常。

6例对照组光镜下HE染色肌纤维无明显变性、坏死，其形态大小正常，结缔组织无明显增生，常规酶组织化学均未见明显异常。

2.5 免疫组织化学染色

81例DMD患者抗dystrophin-N, -C, -R染色中均有一型或两型肌纤维膜完全缺失(图 5A)。所有DMD患者抗dysferlin染色均正常。所有对照组骨骼肌抗dystrophin-N, -C, -R和抗dysferlin染色均未见明显异常(图 5B)。

2.6 半定量Western blot

半定量Western blot表明在DMD患者骨骼肌中LC3-Ⅰ的表达量高于对照组骨骼肌，但LC3-Ⅱ在DMD患者骨骼肌中的表达显著低于对照组骨骼肌(图 6和图 7)；而DMD患者骨骼肌中p62蛋白的表达明显高于对照组(图 8和图 9)。

3 讨论

自噬是真核细胞中广泛存在的降解/再循环系统。一方面它可以帮助细胞清除不正常构型的大分子蛋白质、降解受损的细胞器及入侵微生物，维持细胞的自稳态；另一方面自噬作为一种降解途径，在生长因子不足、营养物质缺乏时，通过降解自身坏死和功能失调物质来生成核苷酸和氨基酸等，实现细胞内物质的再循环和再利用。

LC3是酵母ATG8基因在哺乳动物细胞中的同源物，与其它自噬基因共同参与前自噬泡形成。LC3除定位在自噬体分隔膜上，还存在于自噬体形成各阶段的内外膜上。目前，LC3被认为是自噬比较特异的诊断指标^[3]。LC3有可溶形式的LC3-Ⅰ和脂化形式的LC3-Ⅱ之分。当自体吞噬发生时，LC3的表达上调，生成有活性的LC3-Ⅰ，并经泛素样加工修饰，与磷脂酰乙醇胺结合，生成LC3-Ⅱ并与溶酶体融合实现降解。LC3-Ⅱ的数量或者LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值与自噬泡的数量成正比关系，在某种程度上反映了细胞的自噬活性。

p62是哺乳动物选择性自噬的底物及调节蛋白，同时也是细胞信号传导中心，它能调节不同的细胞进程。选择性自噬可降解蛋白聚集体、异常折叠蛋白、受损细胞器、病毒、细菌以及核糖体，在自噬的初始阶段，p62能招募无法被正常转运的异常折叠蛋白，使其在细胞浆形成聚集小体，并通过泛素化聚集物后形成更大的聚合体，被可以和ATG8蛋白结合的调节蛋白或受体识别^[6]，发挥自噬降解作用。

DMD是因抗肌萎缩蛋白基因突变导致肌无力和肌萎缩，肌变性、坏死、再生循环，最终肌细胞再生疲乏，剩余肌细胞数目减少，同时慢性炎症引起肌纤维被脂肪组织及结缔组织替代。DMD患者存在连续性和进展性的骨骼肌损伤。目前较多研究均强调了自噬在肌肉组织调控中起了至关重要的作用^[7]，如：维持细胞结构和成分，应激反应等，而自噬功能障碍可引起肌纤维的变性、坏死。Bonaldo等研究曾提出：自噬功能障碍是各型肌营养不良症肌细胞坏死机制^[8]。而Palma等^[5]通过观察4个月大的mdx小鼠和野生型(WT)小鼠胫骨前肌(TA)和隔膜肌肉中自噬标记物的表达发现：脂化形式的LC3(LC3-Ⅱ)在mdx小鼠的胫骨前肌和隔膜肌的表达与WT小鼠相比是减少的，p62在mdx小鼠的胫骨前肌和隔膜肌的表达与WT小鼠相比是增加的，提示自噬降解的异常导致了异常蛋白质和细胞器的聚集，证实了自噬在mdx小鼠中是减少的。进而科学家们通过一系列动物实验发现重新激活自噬可改善DMD表型的mdx小鼠骨骼肌细胞。

本研究DMD患者骨骼肌与对照组骨骼肌相比：LC3-Ⅱ的表达明显降低，p62的表达明显增高。此结果与mdx小鼠胫骨前肌和隔膜肌中自噬标记物的表达一致，因此，我们认为：存在于mdx小鼠骨骼肌中的自噬功能障碍同样存在于DMD患者骨骼肌中。

LC3-Ⅱ的减少是自噬受损的一个明确信号，而p62水平的增加进一步证实了自噬潮的减少，同时在超微结构下也能观察到受损细胞器的积累。而有效的重新激活自噬，能使受损骨骼肌中LC3-Ⅱ的水平较前增加和p62的水平较前降低，且超微结构下可见骨骼肌病理表现得到纠正。因此，我们认为：自噬功能障碍存在于DMD患者骨骼肌中，并参与了DMD骨骼肌细胞的坏死过程，重新激活自噬有望能扭转DMD骨骼肌细胞坏死进程，从而产生有益影响。

综上所述，本研究发现DMD患者骨骼肌细胞中LC3-Ⅱ的表达较对照组明显降低，p62的表达较对照组明显增高，提示DMD患者骨骼肌自噬异常可能是自噬潮受到抑制导致的自噬减少。因此，调整合适的自噬潮，有望延缓DMD的肌细胞死亡，成为一种新的DMD治疗策略。