神经胶质瘤是最为常见的原发性中枢神经系统肿瘤。50%~60%的脑部恶性肿瘤都是胶质瘤^[1]。对神经胶质瘤现有的治疗策略主要是手术治疗、放射治疗、化学治疗或其他方式的辅助性治疗^[2-4]。然而，高转移率和对放化疗的耐受性使得胶质瘤的预后效果都很差^[5-7]。我们的研究发现，微小核糖核酸592(miR-592) 在胶质瘤组织中相对于癌旁组织明显表达降低。为了进一步探究miR-592在胶质瘤细胞中作用机制，我们应用miR-592 mimics上调miR-592在胶质瘤细胞 (U251细胞) 中表达水平，研究其对胶质瘤细胞生长和凋亡的影响，并进一步通过实验寻找miR-592的靶分子。

1 材料和方法 1.1 实验材料

胶质瘤细胞U251细胞为新疆医科大学第一附属医院中心实验室自有，28份胶质瘤和癌旁组织为我院自2012年4月至2015年7月所收集神经胶质瘤样本，其中28例胶质瘤样本中Ⅰ级胶质瘤4例 (均为毛细胞型星形细胞瘤)、Ⅱ级4例 (少突胶质细胞瘤及弥漫性星型细胞瘤)、Ⅲ级14例 (少突角质细胞瘤，星形细胞瘤，间变性星形细胞瘤)、Ⅳ级6例 (胶质母细胞瘤)，均由术中切除获得，均经病理验证，且已经过患者或家属知情同意。RPMI-1640培养基和FBS为美国Gibco公司产品，噻唑蓝、二甲基亚砜 (DMSO) 为美国Sigma公司产品，Runx2单克隆抗体购自于Abcam公司，荧光素酶检测试剂盒购自于Promega公司，酶标检测仪为德国MD公司产品，Lipofectamine 2000、Trizol为美国Invitrogen公司产品，miR-592 mimics和siRNA购自于上海吉凯基因公司，miR-592和Runx2定量检测试剂盒为德国QIAGEN公司产品。实时定量聚合酶链反应试剂盒为美国ABI产品，流式细胞仪为美国BD公司产品，PI和Annexin V凋亡染色试剂盒也为美国BD公司产品，其他相关质粒为实验室自有。

1.2 实验方法 1.2.1 细胞培养

人胶质瘤细胞U251以10%的胎牛血清RPMI-1640或DMEM培养基，在37℃、5%CO₂、相对湿度为90%的培养箱中培养。用0.25%的胰酶消化，每2天换液传代。

1.2.2 细胞增殖实验 (噻唑蓝)

以每孔10 000个细胞接种于96孔板中，每组设3个复孔。细胞贴壁后，向细胞转染100 nmol/L的miR-592 mimics或者Runx2的siRNA，以随机序列的mimic作为实验对照，Runx2的siRNA序列如下：Runx2 siRNA：5’-GCACGCUAUUAAAUCCAAATT-3’。12 h后进行第一次检测：每孔加入5g/L的噻唑蓝液20 μl，继续培养到4 h后，去掉培养基，加入DMSO 150 μl，用酶标仪在490 nm检测吸光值。分别于转染后12、24、36 h和48 h测定吸光度 (A) 值。根据测得的A值绘制生长曲线。

1.2.3 RNA提取及实时定量聚合酶链反应 (qRT-PCR)：

所有样本用液氮在研钵中研磨，用TRzol提取总RNA，并通过酶标仪测RNA浓度，A₂₆₀/A₂₈₀为1.8~2.0。将RNA样本稀释成2 ng/μl，按照说明书配置成15 μl的逆转录体系进行逆转。取其中2 μl作为模板配置成20 μl体系进行定量PCR验证。反应条件为95℃ 10 min预变性，95 ℃ 15 s→60 ℃ 30 s进行40个循环，反应结束后得到各个标本和内参GAPDH的Ct值。计算公式：ΔCt＝Ct-Ct_GAPDH，ΔΔCt＝ΔCt (T)-ΔCt (N)，相对表达计算公式为2^-ΔΔCt。定量引物均购自QIAGEN公司，序列如下：Runx2上游引物：5’-GACCAGTCTTACCCCTCCTACC-3’，Runx2下游引物：5’-CTGCCTGGCTCTTCTTACTGAG-3’；GAPDH上游引物：5’-GAGAGACCCCACTTGCTGCCA-3’，GAPDH下游引物：5’-CTCACACTGCCCCTCCCTGGT-3’。

1.2.4 流式细胞技术

以每孔10 000个细胞接种于96孔板中，每组设3个复孔。向细胞转染100 nmol/L的miR-592 mimics或100 nmol/L的Runx2 siRNA，以随机的mimic作为实验对照，序列如前所述。48 h后，用胰酶消化制成单细胞悬液，PBS洗涤3次。按说明书操作进行PI/Annexin V染色细胞，避光染色20 min，流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率，实验重复3次，每次3个复孔。结果用FlowJo软件进行分析。

1.2.5 蛋白免疫印迹实验

加入200 μl RIPA缓冲液冰上20 min裂解细胞。加入50 μl 5X SDS-PAGE上洋缓冲液，煮沸10 min后进行SDS-PAGE。转膜，10%BSA溶液封闭，加入稀释好的抗体工作液，4 ℃过夜孵育，TBST洗膜3次。再加入HRP标记的抗人IgG二抗，TBST洗膜3次后，加上化学发光底物，于暗室内压片、曝光、显影和定影。

1.2.6 荧光素酶双报告实验

以每孔2.0×10⁵个293T细胞接种于24孔板。培养24 h后，用lipofectamine2000将报告质粒和miR-592过表达质粒共转染于293T细胞，并同步共转入pRL-TK作为对照质粒，用量分别为：报告质粒0.4 μg；miR-592过表达质粒0.4 μg；pRL-TK质粒0.05 μg。转染后6 h换完全培养基。48 h后去上清，用PBS洗去未去干净的上清，随后用lysis buffer冰上裂解细胞，收集上清用于荧光素酶活性检测 (试剂盒购自于Promega)。计算方法为：荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶读值/海肾荧光读值。

1.2.7 裸鼠肿瘤模型

建立购买8周龄的BALB/c (nu/nu) 裸鼠 (上海斯莱克)，随机分成3组，每组5只。分别于左、右侧肋部皮下接种miR-592稳定表达的U251细胞、Runx2 siRNA稳定表达的U251细胞 (细胞系均由上海吉凯基因公司制备)，以正常U251细胞作为实验对照，细胞接种量均为6.0×10⁶/只，左右侧各3.0×10⁶个。于接种后每隔5 d游标卡尺测定肿瘤大小，以1/3×长径×短径2计算肿瘤体积，并于接种后第50天处死小鼠，绘制肿瘤生长曲线。

1.3 统计学方法

各组数据均采用SPSS统计软件进行统计学处理。正态分布的计量资料采用均值±标准差，两组间数据比较采用t检验，P < 0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 miR-592促进U251细胞凋亡

首先，我们通过定量PCR的方法分析了miR-592在神经胶质瘤组织和癌旁组织中的表达变化。结果表明miR-592在神经胶质瘤组织中的相对表达明显下降 (图 1A)。

为了进一步研究miR-592是否在胶质瘤的发生发展中发挥着功能性的作用，我们合成了miR-592的mimics，并合成随机序列的对照。脂质体转染U251细胞后，我们首先检测了miR-592的表达 (图 1B)，并通过MTT实验绘制生长曲线 (图 1C)。结果显示，过表达miR-592能明显抑制U251细胞生长。流式细胞实验对U251细胞的凋亡检测结果显示miR-592能显著性上调细胞凋亡率 (图 1D，表 1)。

2.2 Runx2

Runx2是miR-592在U251细胞中的直接靶分子：为了进一步探究miR-592在神经胶质瘤细胞中的作用机制。通过查阅文献我们发现Runx2在神经胶质瘤细胞中发挥着重要作用，我们通过生物信息学分析发现miR-592能直接靶向Runx2的3’-UTR。荧光素酶双报告实验也显示miR-592显著性的抑制带有Runx2的3’-UTR的荧光素酶的活性 (图 2A)。为了进一步验证Runx2是否是miR-592的直接靶分子，我们通过定量PCR的方法分析了Runx2在神经胶质瘤组织和癌旁组织中的表达，结果显示Runx2的相对表达在肿瘤组织中明显上调 (图 2B)。随后我们还通过western blot的方法分析了转染miR-592后U251细胞Runx2蛋白的表达，结果显示miR-592抑制Runx2的蛋白水平 (图 2C)。以上结果表明，Runx2是miR-592在U251细胞中的直接靶分子。

2.3 下调Runx2表达水平抑制U251细胞生长并促进细胞凋亡

为了研究Runx2是否是miR-592在U251细胞中的功能性靶分子，我们设计了Runx2下调的siRNA。转染U251细胞后，western blot实验验证Runx2的表达 (图 3.A)。同时，我们也检测了下调Runx2对U251细胞生长的影响，结果显示转染了Runx2 siRNA的细胞生长明显比对照组低 (图 3.B)。流式细胞技术对周期的检测显示，Runx2下调表达上调U251细胞的凋亡率 (图 3.C和Table 2)。综上所述，下调Runx2表达能重现miR-592过表达的表型，说明Runx2是miR-592的功能性靶分子。

总结以上结果我们得出如下结论：miR-592通过直接靶向Runx2来促进U251细胞凋亡率来抑制细胞生长。

2.4 miR-592通过靶向Runx2调控U251的肿瘤的生长

为了进一步验证Runx2是否为miR-592的功能性的靶分子，进一步通过体内的成瘤实验验证以上疑问。通过在裸鼠皮下接种miR-592稳定表达的U251细胞；Runx2 siRNA稳定表达的U251细胞和对照组U251细胞。于接种后每隔5天测定一次肿瘤大小。并于接种后50天处死小鼠。通过绘制肿瘤的生长曲线，发现miR-592过表达明显抑制肿瘤的生长 (图 4)。同时，我们发现，Runx2的下调表达也明显抑制肿瘤的生长 (图 4)。该实验结果表明，miR-592通过下调Runx2抑制胶质瘤肿瘤生长。

总结以上所有结果，可得出如下结论：miR-592通过靶向Runx2来调控U251细胞的凋亡和肿瘤的生长。

3 讨论

microRNA是一类长度约为22个碱基的非编码RNA。虽然microRNA在哺乳动物细胞中的总体数量很少，但是它们却调节了大约30%的基因。microRNA通过靶向目的分子的3’-UTR来调节mRNA的水平从而进一步调节蛋白的水平^{[8, 9]}。诸多文献报道指出microRNA在肿瘤的发生发展过程中起着各种各样非常重要的作用^[10-13]。我们发现，miR-592在神经胶质瘤组织中的表达显著下调。合成miR-592的mimics并转染U251细胞来过表达miR-592，MTT实验结果显示过表达miR-592显著性的抑制细胞生长。流式细胞检测表明，过表达miR-592上调U251细胞的凋亡率。这些结果表明，miR-592在神经胶质瘤细胞中发挥着肿瘤抑制基因的功能。

Runx2是Runt相关转录因子家族的重要成员^[14]。它可以形成核心结合因子 (CBF) 复合物结合到DNA序列上，从而达到对基因表达的调控作用^[15]。越来越多的研究表明Runx2在包括胶质瘤在内的多种肿瘤中都有表达。Runx2的高表达能促进肿瘤的生长、转移和浸润^[16-17]。而下调Runx2的表达又可以抑制肿瘤的生长和发生发展^[18]。这些结果表明Runx2发挥着肿瘤抑制因子的功能。应用荧光素酶双报告实验，发现miR-592能直接和Runx2的UTR结合。而在肿瘤组织中Runx2的表达也明显上调，western blot实验结果也显示过表达miR-592的U251细胞的Runx2的表达明显下调。以上结果表明，Runx2是miR-592在U251细胞中的直接靶分子。

为了进一步研究Runx2是否是miR-592在U251细胞中的功能性靶分子，我们通过siRNA特异性的沉默Runx2的表达。MTT实验结果表明，下调Runx2显著性的抑制U251细胞的生长，其凋亡水平也明显上调。这个结果表明，Runx2是miR-592在U251细胞中的功能性靶蛋白。

综上所述，我们得出以下结论：miR-592通过直接靶向Runx2促进凋亡来抑制U251细胞生长。