国际神经病学神经外科学杂志  2017, Vol. 44 Issue (1): 44-48

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林芳, 任阳, 冯琳, 刘伟
LIN Fang, REN Yang, FENG Lin, LIU Wei
2型糖尿病患者基质金属蛋白酶-12基因多态性与缺血性卒中的相关性研究
Association between matrix metalloproteinase-12 gene polymorphisms and ischemic stroke in patients with type 2 diabetes
国际神经病学神经外科学杂志, 2017, 44(1): 44-48
Journal of International Neurology and Neurosurgery, 2017, 44(1): 44-48

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收稿日期: 2016-10-20
修回日期: 2017-01-05
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林芳, 任阳, 冯琳, 刘伟. 2型糖尿病患者基质金属蛋白酶-12基因多态性与缺血性卒中的相关性研究[J]. 国际神经病学神经外科学杂志, 2017, 44(1): 44-48.
LIN Fang, REN Yang, FENG Lin, LIU Wei. Association between matrix metalloproteinase-12 gene polymorphisms and ischemic stroke in patients with type 2 diabetes[J]. Journal of International Neurology and Neurosurgery, 2017, 44(1): 44-48.
2型糖尿病患者基质金属蛋白酶-12基因多态性与缺血性卒中的相关性研究
林芳, 任阳, 冯琳, 刘伟     
延安大学附属医院老年病科, 陕西省延安市 716000
收稿日期: 2016-10-20; 修回日期: 2017-01-05
作者简介: 林芳 (1980-), 女, 本科, 主治医师, 主要从事老年病神经方面治疗的研究。E-mail:linfang198009@163.com。
通信作者: 刘伟, 本科, 副主任医师, E-mail:3081548@qq.com。
摘要: 目的 探讨2型糖尿病患者基质金属蛋白酶12（MMP-12）基因多态性与缺血性卒中的相关性。 方法 选择2013年1月至2015年12月在本科治疗的217例2型糖尿病合并缺血性卒中患者作为病例组，按照TOAST分型结果将病例组患者分为大动脉粥样硬化性卒中（LAA）组88例和非大动脉粥样硬化性卒中（n-LAA）组129例，选择同期在我院体检的无缺血性卒中的2型糖尿病患者100例作为对照组，采用聚合酶链反应-限制性内切酶分析（PCR-RFLP）法比较MMP-12（-82 A/G）和MMP-12（-1082 A/G）基因型多态性在各组间的差异。 结果 病例组和n-LAA组MMP-12（82 A/G）基因型和等位基因与对照组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。LAA组（G/G+A/G）基因型频率显著高于对照组（22.73% vs 11.00%，P=0.031）；G等位基因频率也高于对照组（18.18% vs 10.05%，P=0.033）。n-LAA组MMP-12（-1082 A/G）基因型和等位基因与对照组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。病例组和LAA组（G/G+A/G）基因型频率均显著高于对照组（33.64% vs 22.00%，P=0.036；37.50% vs 22.00%，P=0.020）；两组G等位基因频率也均高于对照组（25.58% vs 17.00%，P=0.017；30.68% vs 17.00%，P=0.002）。多因素Logistic回归分析结果显示MMP-12-82A/G等位基因G和MMP-12-1082A/G等位基因G均是2型糖尿病患者发生LAA的危险因素（OR=1.107，95%CI 1.010-1.371，P=0.031；OR=1.285，95%CI 1.142-1.817，P=0.010）。 结论 对于2型糖尿病患者，MMP-12基因-82位点G等位基因和-1082位点G基因多态性与大动脉粥样硬化性卒中密切相关。
关键词： 2型糖尿病     缺血性卒中     基质金属蛋白酶-12     基因多态性    
Association between matrix metalloproteinase-12 gene polymorphisms and ischemic stroke in patients with type 2 diabetes
LIN Fang, REN Yang, FENG Lin, LIU Wei     
Department of Geriatrics, Affiliated Hospital of Yan'an University, Yan'an, Shanxi 716000, China
Abstract: Objective To investigate the association between matrix metalloproteinase-12 (MMP-12) gene polymorphisms and ischemic stroke in patients with type 2 diabetes. Methods A total of 217 patients with type 2 diabetes complicated by ischemic stroke who were treated in our department from January 2013 to December 2015 were enrolled as case group, and according to the TOAST type, they were divided into large artery atherosclerosis (LAA) group (88 patients) and non-LAA group (n-LAA group, 129 patients). A total of 100 patients with type 2 diabetes who had no ischemic stroke and underwent physical examination in our hospital during the same period of time were enrolled as control group. Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism was used to measure the differences in MMP-12 (-82 A/G) and MMP-12 (-1082 A/G) gene polymorphisms between groups. Results There were no significant differences in the frequencies of MMP-12 (82 A/G) genotypes and alleles between the case group and the control group, as well as between the n-LAA group and the control group (P>0.05). Compared with the control group, the LAA group had significantly higher frequencies of (G/G+A/G) genotypes (22.73% vs 11.00%, P=0.031) and G allele (18.18% vs 10.05%, P=0.033). There were no significant differences in the frequencies of MMP-12 (-1082 A/G) genotypes and alleles between the n-LAA group and the control group (P>0.05). Compared with the control group, the case group and the LAA group had significantly higher frequencies of (G/G+A/G) genotypes (33.64%/37.50% vs 22.00%, P=0.036 and P=0.020) and G allele (25.58%/30.68% vs 17.00%, P=0.017 and P=0.002). The multivariate logistic regression analysis showed that G allele at MMP-12-82A/G (OR=1.107, 95% CI 1.010-1.371, P=0.031) and G allele at MMP-12-1082A/G (OR=1.285, 95% CI 1.142-1.817, P=0.010) were risk factors for the development of LAA in patients with type 2 diabetes. Conclusions For patients with type 2 diabetes, gene polymorphisms of G allele in MMP-12 (-82 A/G) and MMP-12 (-1082 A/G) may be closely associated with LAA.
Key words: type 2 diabetes     ischemic stroke     matrix metalloproteinase-12     gene polymorphism    

我国最新的全国公民死亡原因调查结果显示缺血性卒中已成为我国公民致死、致残最主要的疾病之一。积极做好缺血性卒中的防治工作，减少缺血性卒中的发生，对降低社会经济负担，提高我国公民健康水平均有重要意义。基质金属蛋白酶 (matrix metalloproteinase, MMPs) 在人体内广泛表达，可有效降解细胞外基质[1, 2]。有研究发现缺血性卒中患者急性期可伴随血清多种MMPs的升高，包括MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9和MMP-10等，还有些研究发现多种MMPs基因多态性与缺血性卒中发生密切相关[3, 4]。MMP-12作为MMPs家族的一员，既往研究主要认为其参与多种肿瘤的转移，近年来有研究发现MMP-12可能参与动脉粥样硬化斑块的形成和进展过程[5-7]。2型糖尿病作为缺血性卒中的重要危险因素，尤其在动脉粥样硬化斑块的形成、发展过程中起到显著的促进作用，本研究以2型糖尿病患者作为主要研究对象，比较MMP-12基因多态性与缺血性卒中之间的关系，为脑卒中预防提供参考。

1 对象与方法 1.1 研究对象 1.1.1 病例组

选择2013年1月至2015年12月我科治疗的217例2型糖尿病合并缺血性卒中患者作为病例组。

入组标准：①年龄45~80岁；②出生并长期生活于陕西地区的汉族人；③2型糖尿病诊断符合2007年《中国2型糖尿病防治指南》诊断标准[8]；④缺血性卒中诊断符合2010年《中国急性缺血性卒中诊治指南》诊断标准[9]。

排除标准：①外伤导致的卒中；②肝、肾等重要脏器合并严重器质性病变或功能障碍；③近期服用影响凝血功能相关药物；④合并颅内或全身感染；⑤恶性肿瘤患者；⑥妊娠期妇女；⑦精神病、有意识障碍。

参照TOAST (Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment) 分型标准[10]将病例组患者分为大动脉粥样硬化性卒中 (large artery atherosclerosis, LAA)88例和非大动脉粥样硬化性卒中 (n-LAA) 组129例。

1.1.2 对照组

参照病例组患者的年龄和性别构成比例，选择100例同期于我院体检中心接受体检的2型糖尿病患者作为对照组，所有对照组成员已行头颅CT和 (或) MR检查，排除缺血性卒中、脑出血，颅脑肿瘤及其他恶性肿瘤可能。

本研究通过本院伦理委员会审核批准，所有入组患者充分知情同意。

1.2 主要仪器与试剂

2720型PCR仪 (美国ABI公司)；高速冷冻离心机 (德国Eppendorf公司)；DY-1稳压稳流电泳仪 (江苏省兴化市分析仪器厂)；纯水和超纯水系统 (美国Millipore公司)；人血DNA提取试剂盒 (北京天根生化科技公司)；所有引物均由上海生物工程有限公司合成。

1.3 基因多态性检测方法

采集所清晨空腹时外周静脉血，采用氯仿饱和酚法提取基因组DNA。应用聚合酶链反应-限制性片段多态性 (Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Length Polymorphism, PCR-RFLP) 法检测MMP-12基因多态性。MMP-12基因多态性包括两个位点，其引物序列分别为MMP-12-82A/G：上游引物5’-GAG ATA GTC AAG GGA TGA TAT CAG C-3’，下游引物5’-AAG AGC TCC AGA AGC AGT GG-3’；MMP-12 1082 A/G：上游引物5’-GGG ATA ATT TGG CTC TGG TCT TCA A-3’，下游引物5’-CCA TGG GAA CCA TAG AAA AGA-3’。PCR反应体系 (25 μL) 包括：10×Buffer 2.5 μL，上、下游引物各1 μL，dNTP混合物2 μL，TaqDNA聚合酶0.2 5μL，模板DNA 1 μL，不足部分由灭菌蒸馏水补足。反应条件为95℃预变性4 min，然后按照95℃ 20 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s顺序循环30周期，最后72℃延长3 min。MMP-1和MMP-9的扩增产物分别使用限制性内切酶PvuⅡ和MfeⅠ进行酶切，酶切体系 (20 μL) 包括：PCR产物17 μL，10×Buffer 2 μL和内切酶1 μL，反应条件为37℃ 16 h，然后65℃ 10 min终止反应。最后取酶切产物进行电泳，紫外灯下观察并摄片。

1.4 统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件分析处理，本研究计量资料均服从正态分布，结果以均数±标准差 (x±s) 表示，两组均数比较采用t检验，多组均数比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用Dunnett-t检验；计数资料结果以构成百分比 (%) 表示，组间比较采用χ2检验。基因型分布采用Hardy-Weinberg平衡定律检验。采用多因素Logistic回归分析法综合评价各因素与缺血性卒中间的关系。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 患者基本临床资料比较

病例组与对照组比较，两组患者在年龄、性别、体重指数 (BWI)、收缩压 (SBP)、舒张压 (DBP)、甘油三酯 (TG)、总胆固醇 (TC)、低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-C) 及空腹血糖 (FBG) 等方面差异均无统计学意义 (P>0.05)。而在吸烟 (46.54% vs 33.00%) 和高血压 (29.03% vs 14.00%) 两方面，两组间差异均有统计学意义 (χ2=5.146, P=0.023; χ2=8.411, P=0.004)。将病例组分为LAA组和n-LAA组后，两个亚组分别与对照组比较，各项参数中同样仅吸烟和高血压2项与对照组相比差异具有统计学意义 (P < 0.05)。见表 1。

表 1 患者基本临床资料比较
指标 病例组 (n=217) 病例组 (n=217) 对照组 (n=100)
LAA组 (n=88) n-LAA组 (n=129)
年龄 (岁) 61.24±7.46 61.83±7.58 60.83±7.19 61.82±7.81
男性n(%) 142(65.44) 59(67.05) 83(64.34) 66(66.00)
吸烟n(%) 101(46.54)a 42(47.73)a 59(45.74)a 33(33.00)
高血压n(%) 63(29.03)a 28(31.82)a 35(27.13)a 14(14.00)
BWI (kg/m2) 24.11±3.71 24.32±3.60 23.97±3.82 23.91±3.20
SBP (mmHg) 136.15±18.21 138.32±19.02 134.67±17.52 136.32±19.38
DBP (mmHg) 87.62±12.46 88.39±12.88 87.09±12.03 87.93±11.59
TG (mmol/L) 1.54±0.62 1.58±0.56 1.51±0.66 1.56+±0.70
TC (mmol/L) 4.11±0.97 3.97±1.04 4.21±0.93 4.00±1.06
LDL-C (mmol/L) 2.65±0.82a 2.64±0.80 2.66±0.83 2.40±0.92
HDL-C (mmol/L) 1.19±0.21 1.18±0.22 1.20±0.20 1.18±0.25
FBG (mmol/L) 4.86±1.38 4.93±1.41 4.81±1.36 4.78±1.55
注：a为与对照组比较，P < 0.05。
表选项
2.2 基因型和等位基因分布

病例组MMP-12 (-82A/G) 基因型和等位基因与对照组比较均无统计学意义。将病例组分为LAA组和n-LAA组后分别与对照组进行比较，LAA组 (G/G+A/G) 基因型频率显著高于对照组 (P=0.031)；G等位基因频率显著高于对照组 (P=0.033)。n-LAA组基因型和等位基因与对照组比较差异均无统计学意义。对于MMP-12基因-1082位点，病例组和LAA组 (G/G+A/G) 基因型频率均显著高于对照组 (P=0.036; P=0.020)；G等位基因频率显著高于对照组 (P=0.017; P=0.002)；n-LAA组基因型和等位基因与对照组比较差异均无统一学意义。见表 2。

表 2 MMP-12基因型和等位基因分布
基因型和等位基因 病例组 (n=217) 病例组 (n=217) 对照组 (n=100)
LAA组 (n=88) n-LAA组 (n=129)
-82A/G
A/A 176(81.11) 68(77.27) 107(82.95) 89(89.00)
G/G+A/G 41(18.89) 20(22.73)a 22(17.05) 11(11.00)
等位基因 (%)
A 85.25 81.82 86.82 89.50
G 14.75 18.18a 13.18 10.50
1082A/G
A/A 144(66.36) 55 (62.50) 89(68.99) 78(78.00)
G/G+A/G 73(33.64)a 33(37.50)a 40(31.01) 22(22.00)
等位基因 (%)
A 74.42 69.32 77.91 83.00
G 25.58a 30.68a 22.09 17.00
注：a为与对照组比较，P < 0.05。
表选项
2.3 多因素Logistic回归分析

采用二分类多因素Logistic后退逐步回归法分析，结果显示对于2型糖尿病患者，除吸烟和高血压外，MMP-12基因-82位点等位基因G (OR=1.107, 95%CI 1.010-1.371, P=0.031) 和-1082位点等位基因G (OR=1.285, 95%CI 1.142-1.817, P=0.010) 均是发生大动脉粥样硬化性卒中的独立危险因素。见表 3。

表 3 多因素Logistic回归分析结果
变量 OR 95% CI P值
吸烟 1.372 1.163-2.165 0.008
高血压 1.163 0.917-1.392 0.094
-82位点G等位基因 1.107 1.010-1.371 0.031
-1082位点G等位基因 1.285 1.142-1.817 0.010
表选项
3 讨论

越来越多基础研究结果显示多种MMPs与动脉粥样硬化密切相关，其中就包括MMP-12。目前研究认为关于MMP-12参与动脉粥样硬化的可能机制包括：①参与动脉内皮损伤的起始阶段，Matsumoto等[11]比较高胆固醇饮食组和对照组日本兔主动脉中MMP-12的表达情况，结果显示高胆固醇饮食组主动脉可见泡沫细胞，组织中MMP-12水平也明显升高。②破坏血管基底膜，增加单核/巨噬细胞进入血管内膜，Yamada等[5]研究发现hMMP-12转基因组实验兔血管内膜单核巨噬细胞侵润多于对照组。③参与血管内弹力层的降解，释放出大量肽类物质进一步增加单核巨噬细胞增殖聚集[12]。④MMP-12是不稳定斑块的因素之一，Morgan等[13]研究发现MMP-12参与动脉斑块纤维帽的降解，可增加斑块破裂的风险。近年来有临床研究发现MMP-12可能与缺血性卒中及无症状颈动脉粥样硬化相关[14]，本研究因多数患者入院时超过急性检测时间窗24 h，MMP-12血清水平资料记录不完整，未对各组血清MMP-12进行比较。

MMP-12的基因定位于人染色体11q22.2~22.3，全长1800 bp，包含9个内含子和10个外显子，关于其表达调控主要表现在转录水平[15, 16]。MMP-12-82A/G多态是MMP-12基因多态性研究较多的一个位点，-82A/G多态位于MMP-12基因转录启动子上游82处，可通过调控MMP-12与转录因子之间亲和力，参与MMP-12表达调控。目前关于MMP-12-82A/G多态与缺血性卒中之间相关性的研究结果差异较大，如李卫玲等[6]研究结果显示动脉粥样硬化性脑梗死组患者与健康对照组比较，MMP-12-82A/G基因型和等位基因差异均无统计学意义。Chehaibi等[16]根据缺血性动脉组患者是否合并2型糖尿病分成两个亚组，结果显示合并糖尿病组MMP-12-82A/G基因型G/G+A/G多于对照组，等位基因G也明显多于对照组。还有研究通过比较2型糖尿病患者与健康正常人发生动脉粥样硬化时MMPs表达和分布情况，发现在糖尿病动脉粥样硬化病变血管及粥样斑块中MMPs表达增强及基质降解活性增强，解释了糖尿病患者易于发生动脉粥样硬化斑块破裂的原因，也提示对于2型糖尿病患者，MMPs与缺血性卒中发作密切相关[17]。这些研究结果提示MMP-12参与缺血性卒中的机制是复杂的，可能是多因素共同参与的结果。因此，本研究将2型糖尿病患者作为研究人群，探索MMP-12基因多态性与缺血性卒中间的关系，结果表明在2型糖尿病患者人群中，缺血性卒中组MMP-12-82A/G的基因型和等位基因与对照组比较均无统计学意义，但LAA组MMP-12-82A/G基因型G/G+A/G频率显著高于对照组，等位基因G显著高于对照组。MMP-12 1082A/G多态是近年来新发现的MMP-12表达调控位点，已有研究表明-1082A/G多态与多种肿瘤转移及COPD发生发展相关[16]，本研究观察其与缺血性卒中的相关性，结果显示病例组和LAA组 (G/G+A/G) 基因型频率和G等位基因均显著高于对照组，n-LAA组基因型和等位基因与对照组比较差异无统一学意义。本研究还采用多因素Logistic回归分析法综合分析2型糖尿病患者发生LAA的危险因素，结果显示MPP-12基因-82位点等位基因G和-1082位点等位基因G均是2型糖尿病患者发生LAA的危险因素，再次表明MMP-12和大动脉粥样硬化卒中之间存在相关性。

综上所述，MMP-12-82A/G和-1082A/G多态性均是2型糖尿病患者发生大动脉粥样硬化性卒中的危险因素。MMP-12基因多态性与其他因素相互作用可能是未来缺血性卒中防治工作的研究热点。

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