脑卒中是一种常见的心脑血管疾病，具有高发病率、高致残率、高死亡率及高复发率等特点，是当前严重危害人类健康的世界性公共卫生问题^[1]，脑梗死占脑卒中发生率的第一位，也是脑卒中死亡的第一位原因^[2]。动脉粥样硬化是其最常见的病因。囊泡相关膜蛋白8(vesical-associated membrane protein 8, VAMP8) 基因是一个参与血小板脱颗粒的基因，通过编码血小板致密核颗粒，α颗粒和溶菌体分泌所必须的囊泡停靠蛋白，调控血小板活化并参与动脉粥样硬化的发生发展^[3]。因此，进一步研究VAMP8基因多态性分布，对动脉粥样硬化性脑梗死 (atherosclerotic cerebral infarction, ACI) 早期预警有重要意义。本研究采用病例对照方法，通过对VAMP8基因rs13426038和rs10666612基因型频率和等位基因频率进行分析，旨在探讨湖南地区汉族人群VAMP8基因rs13426038和rs10666612多态性与ACI的相关性。

1 对象与方法 1.1 研究对象

病例组为2009年至2012年到中南大学湘雅医院神经内科住院的脑梗死患者，并均经临床表现、CT和 (或) MRI确诊 (依照第四届全国脑血管病学术会议诊断标准)，根据2007年韩国改良的TOAST分型标准筛选出动脉粥样硬化性脑梗死患者作为ACI组。

对照组成员为随机收集的中南大学湘雅医院健康体检者，且相互之间无血缘关系，性别与年龄与ACI组相配。

两组均为湖南地区汉族人，均排除：心源性、动脉炎、外伤、血液病、药物、肿瘤、脑血管畸形或动脉瘤等引起的脑梗死；有严重肝、肾功能疾病的病例及自身免疫性疾病、妊娠者、甲状腺疾病，半年内曾降脂治疗者和最近6个月服用雌激素患者。

每位入组者均签署知情同意书，并经中南大学湘雅医院伦理委员会批准同意。

1.2 研究方法 1.2.1 一般资料收集

收集所有受试者的资料，包括性别、年龄、吸烟史、饮酒史、糖尿病史、高血压病史、冠心病病史、高脂血症史；其空腹血糖 (fasting plasma glucose, FPG) 和血脂检测由医院检验科完成。

1.2.2 基因组DNA提取及基因多态性检测

所有受试者均抽取空腹12 h静脉血约5 ml，EDTA抗凝，常规酚/氯仿抽提法提取DNA。根据NCBI数据库，本研究主要选择VAMP8两个位于启动子区多态性位点 (rs13426038和rs10166612) 进行检测。

1.2.3 PCR扩增及基因型鉴定

从NCBI的GenBank数据库 (http://www.ncbi.nlm.Gov/Genbank/, accessionnumberNT-007819) 中检索VAMP8基因序列，利用专业引物设计软件Primer5设计引物 (表 1)，由上海生工生物技术有限公司合成。PCR总反应体系15 μl，包含DNA模板1 μl，上下游引物各0.25 μl，2*Taq PCR Master Mix 7.5 μl (含缓冲液、DNA聚合酶、dNTP和MgCL2)，加双蒸水至15 μl；PCR扩增条件：冷启动，95℃预变性3 min，94℃变性30 s，退火50 s (退火温度rs13426038 57℃；rs10166612 59.2℃)，72℃延伸50 s，共39个循环，最后72℃延伸4 min，4℃终止反应.；用限制性内切酶BclI (rs13426038)、Alu (rs10166612)，分别在55℃、37℃酶切相应的PCR扩增产物，然后用2%的琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，用凝胶分析系统观察电泳结果 (图 1、图 2)。

1.2.4 基因型鉴定

rs13426038位点经BclI酶切后测序验证，鉴定出CC、CG、GG 3种基因型；rs10166612位点经Alu Ⅰ酶切后测序验证，鉴定出AA、AG、GG 3种基因型。

1.3 统计学分析

所有数据统计分析采用SPSS 18.0软件。以基因计数法计算基因型和等位基因频率，采用Hardy-Weinberg平衡法检测样本的群体代表性，组间基因型和等位基因频率比较用χ²检验；计量资料数据用均数±标准差 (x±s) 描述，并进行正态性检验，符合正态分布的两组间计量资料的比较采用独立t检验，病例组和对照组基因型频率与等位基因频率的比较并计算比值比 (odds ratio, OR) 及其95%的置信区间 (confidence index, CI)。P < 0.05为具有统计学意义。

2 结果 2.1 ACI组与对照组临床数据比较

本研究的两个SNP位点所纳入的动脉粥样硬化性脑梗死 (ACI) 组和对照组在年龄、性别、BMI、饮酒史、TC上差异均无统计学意义 (P>0.05)；ACI组中有吸烟史者与对照组相比有统计学差异 (P < 0.05)；ACI组收缩压、舒张压、LDL-C、FPG显著高于对照组 (P < 0.05)。对照组HDL水平明显高于ACI组 (P < 0.05)。见表 2、表 3。

2.2 基因多态性分析

中国湖南地区汉族人群中存在VAMP8基因rs13426038C/G和rs10166612A/G多态性，且基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡检验。

VAMP8基因rs13426038位点CC、CG和GG基因型频率在ACI组分别为20.5%、43.6%和35.9%，等位基因C和G的频率分别为42.3%和57.7%；对照组rs13426038 CC、CG和GG基因型频率分别为15.0%、49.0%和36.0%；C和G等位基因频率分别为39.9%和60.5%；两组间基因型及等位基因频率分布比较差异无统计学意义 (P>0.05)。见表 3。

VAMP8基因rs10166612位点AA、AG和GG基因型频率在ACI组分别为92.7%、6.8%和0.5%，A和G等位基因频率分别为96.1%和3.9%；对照组分别为91.8%、8.2%和0%，A和G等位基因频率分别为95.9%和4.1%；两组间基因型及等位基因频率分布比较差异无统计学意义 (P>0.05)。见表 4。

3 讨论

动脉粥样硬化是脑梗死最常见的病因及重要的病理生理学基础^{[4, 5]}，众多研究表明，血小板活化与动脉粥样硬化的发生发展密切相关^{[6, 7]}。VAMP8是一种血小板内涵体的囊泡可溶性黏附蛋白受体，是血小板致密核颗粒，α颗粒和溶菌体分泌所必须的囊泡停靠蛋白，参与血小板颗粒包膜和开放小管系统间的直接融合以及颗粒间的混合融合^[8]。Gwenda等^[9]通过研究VAMP8基因缺失 (VAMP8^-/-) 的大鼠模型，发现Vamp8基因缺失的血小板在所有3个颗粒 (致密颗粒、α颗粒和溶菌体) 释放的动力学上有明显的缺陷，以及VAMP8^-/-的大鼠血管损伤后血栓形成延迟并减弱。Kondkar等^[10]研究发现高活化性血小板VAMP8 mRNA表达及VAMP8蛋白水平分别高于低活化性血小板4.8倍和2.5倍。这些研究均提示VAMP8在血小板活化和促凝物质的释放起着重要的调节作用。

VAMP8基因位于2号染色体中一个宽度为68 Mbp的尖端区域中，含有303 bp的开放读码框，编码101个氨基酸的蛋白质 (VAMP8)。目前对于VAMP8基因多态性与冠心病的研究较多，段成城等发现冠心病患者VAMP8 rs1010等位基因频率显著高于对照组^[11]。Shiffman等^[12]也在研究心肌梗死病例组1200例和正常对照组262名实验中，发现VAMP8多态性与心肌梗死显著相关。目前，尚未有VAMP基因多态性与脑梗死的研究，鉴于心脑血管疾病有相似发病机制及危险因素^[13]，VAMP8可能为脑梗死重要的致病候选基因。本研究首次进行VAMP8多态性与脑梗死研究，选取位于VAMP8启动子区两个多态性位点rs13426038和rs10166612，对ACI和正常对照组人群进行检测，发现都存在3种基因型，分别为CC、CG、GG和AA、AG、GG，提示湖南汉族人群中存在rs13426038和rs10166612多态性，且符合Hardy-Weinberg遗传平衡检验，说明样本具有较好的代表性。但是通过统计学分析显示，ACI组与对照组间rs13426038和rs10166612的基因型与等位基因频率分布比较均无显著性差异，提示VAMP8 rs13426038和rs10166612多态性可能与湖南汉族人群动脉粥样硬化性脑梗死无关。我们考虑，未发现关联性的原因除了可能与样本数量、选择及分类偏倚性有关，还可能和脑梗死发病因素多样性有关，脑梗死的发生发展是多位点、多基因及多种环境因素共同作用的结果，且各因素间存在交互作用，下一步我们可选择更多位点、更多基因，或进行基因连锁研究，来探索脑梗死的发病遗传学机制。