国际神经病学神经外科学杂志  2017, Vol. 44 Issue (1): 35-38

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孙新刚, 马乾, 王改青, 王荔, 胡为民
SUN Xin-Gang, MA Qian, WANG Gai-Qing, WANG Li, HU Wei-Min
p38丝裂原活化蛋白激酶在实验性蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中的作用
Role of p38 mitogen-activated protein kinase in early brain injury after experimental subarachnoid hemorrhage
国际神经病学神经外科学杂志, 2017, 44(1): 35-38
Journal of International Neurology and Neurosurgery, 2017, 44(1): 35-38

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收稿日期: 2016-10-24
修回日期: 2017-01-03
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孙新刚, 马乾, 王改青, 王荔, 胡为民. p38丝裂原活化蛋白激酶在实验性蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中的作用[J]. 国际神经病学神经外科学杂志, 2017, 44(1): 35-38.
SUN Xin-Gang, MA Qian, WANG Gai-Qing, WANG Li, HU Wei-Min. Role of p38 mitogen-activated protein kinase in early brain injury after experimental subarachnoid hemorrhage[J]. Journal of International Neurology and Neurosurgery, 2017, 44(1): 35-38.
p38丝裂原活化蛋白激酶在实验性蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中的作用
孙新刚, 马乾, 王改青, 王荔, 胡为民     
山西医科大学第二医院神经内科, 山西省太原市 030001
收稿日期: 2016-10-24; 修回日期: 2017-01-03
基金项目: 山西医科大学第二医院博士基金项目（201501-7）
作者简介: 孙新刚 (1982-), 男, 副主任医师, 博士, 硕士生导师, 主要从事脑血管病的基础与临床研究。E-mail:sunyanxia820701@163.com。
摘要: 目的 探讨p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）在蛛网膜下腔出血（SAH）后早期脑损伤（EBI）中的作用。 方法 成年雄性SD大鼠随机分配至对照组、SAH组及p38MAPK干预组，每组18只。采用血管内穿刺法制作SAH模型，干预组于术前30 min经侧脑室注射p38MAPK特异性抑制剂SB203580，造模后24 h处死。观察各组大鼠脑含水量和神经功能评分，RT-PCR及免疫组化检测脑组织p38MAPK表达。 结果 与对照组相比，SAH组大鼠脑含水量（t=-196.35，P < 0.01）及p38MAPK的mRNA水平（t=-24.75，P < 0.01）均明显升高，神经功能评分明显减低（t=201.08，P < 0.01）。与SAH组相比，干预组脑含水量（t=75.67，P < 0.01）及p38MAPK的mRNA水平（t=9.43，P < 0.01）均明显下降，神经功能评分明显升高（t=-81.68，P < 0.01）。免疫组化示SAH组及干预组均有p38MAPK表达，但干预组较SAH组表达水平明显下降（t=-3.37，P < 0.01）。 结论 p38MAPK在EBI形成机制中起重要作用，有望成为防治EBI的药物作用新靶点。
关键词： 蛛网膜下腔出血     早期脑损伤     p38丝裂原活化蛋白激酶     炎症反应    
Role of p38 mitogen-activated protein kinase in early brain injury after experimental subarachnoid hemorrhage
SUN Xin-Gang, MA Qian, WANG Gai-Qing, WANG Li, HU Wei-Min     
Department of Neurology, the Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China
Abstract: Objective To investigate the role of p38 mitogen-activated protein kinase (p38 MAPK) in early brain injury (EBI) after experimental subarachnoid hemorrhage (SAH). Methods A total of 54 adult male Sprague-Dawley (SD) rats were equally and randomly divided into SAH group, control group, and p38 MAPK intervention group. An SAH model was established using intravascular silk puncture. The intervention group was given an intracerebroventricular injection of SB203580 (a specific inhibitor of p38 MAPK) at 30 minutes before modeling. All SD rats were sacrificed at 24 hours after modeling. The brain water content and neurological function score were determined. The expression of p38 MAPK in the brain was measured by RT-PCR and immunohistochemistry. Results The SAH group had significantly higher brain water content and mRNA level of p38 MAPK and a significantly lower neurological function score compared with the control group (t=-196.35, P < 0.01; t=-24.75, P < 0.01; t=201.08, P < 0.01). The p38 MAPK intervention group had significantly lower brain water content and mRNA level of p38 MAPK and a significantly higher neurological function score compared with the SAH group (t=75.67, P < 0.01; t=9.43, P < 0.01; t=-81.68, P < 0.01). The immunohistochemistry results showed that p38 MAPK protein was expressed only in the SAH group and the p38 MAPK intervention group, and the p38 MAPK group had significantly lower expression of p38 MAPK protein than the SAH group (t=-3.37, P < 0.01). Conclusions p38 MAPK plays an important role in the formation of EBI, and it may be a new drug target for the prevention and treatment of EBI.
Key words: subarachnoid hemorrhage     early brain injury     p38 mitogen-activated protein kinase     inflammatory response     rat    

早期脑损伤early brain injury, EBI) 是导致蛛网膜下腔出血 (subarachnoid hemorrhage, SAH) 患者预后不佳的主要原因[1]，炎症反应是其主要形成机制[2]。p38丝裂原活化蛋白激酶 (p38 mitogen-activated protein kinase, p38MAPK) 在多种炎症反应中起关键作用，但其在EBI形成中的作用鲜有报道。本研究拟以p38MAPK为切入点，对EBI的形成机制进行探讨，旨在为临床防治EBI提供新策略。

1 材料与方法 1.1 实验动物分组

成年雄性SD大鼠54只，体重250~300 g，随机数字表法分为SAH组，对照组及p38MAPK干预组，每组18只，其中6只用于RT-PCR检测脑组织p38MAPK的mRNA，6只用于免疫组化检测脑组织p38MAPK蛋白表达，6只用于检测脑含水量。若动物死亡则随机补充，以保证每组样本量。

1.2 动物模型制作及标本处理

据文献方法，采用血管内穿刺法制作SAH组动物模型[3]。对照组大鼠采用相同手术过程，但不穿破血管壁。参考文献方法，干预组于术前30 min经侧脑室注射10 μL的p38MAPK特异性抑制剂SB203580，每只大鼠所用SB203580的浓度据其体重计算，使每只大鼠所用剂量为5 μmol/kg[4]。参照文献方法[5, 6]，动物建模后24 h处死，断头取脑后取穿刺侧颞叶基底部脑组织为实验标本[7]。拟用于免疫组化检测的大鼠，取适当大小标本放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h备用。拟用于RT-PCR检测的大鼠，取适当大小标本装入微量离心管内，同上清液置入-70℃冰箱内保存备用。拟用于脑含水量检测的大鼠切取适当大小标本后直接测量。

1.3 神经功能评分

所有动物处死前行神经功能评分。评分方法参照Garcia标准，共包括6项：四肢运动对称性，攀爬运动，前爪伸展性，自主运动，肢体本体感觉及触须反应，得分越低神经功能缺失越严重。

1.4 脑含水量检测

评估大鼠脑含水量的方法如下：断头取脑并切取适当大小血肿周围脑组织后直接称质量 (湿质量)，后在105℃烤箱中烘烤72 h，随后再称质量 (干质量)。脑含水量=(湿质量-干质量)/湿质量×100%。

1.5 p38MAPK表达检测 1.5.1 RT-PCR检测

取出-70℃冰箱中保存的标本，按说明书依次进行提取总RNA，合成第1、2链，电泳分析等步骤。凝胶图像分析系统检测灰度，p38MAPK/β-actin比值表示p38MAPK的mRNA相对水平。

1.5.2 免疫组化检测

按参照文献方法制作石蜡切片[8]，进行SABC染色并检测p38MAPK表达；按参考文献方法采用量化评分表评价p38MAPK的表达程度[9]。

1.6 统计学分析

数据以SPSS 18.0统计软件处理，计量资料以均数±标准差 (x±s) 表示，组间比较采用t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组动物神经功能评分及脑含水量比较

与对照组相比，SAH组脑含水量 (t=-196.35, P < 0.01) 明显升高，神经功能评分 (t=201.08, P < 0.01) 明显下降。干预组与对照组相比，脑含水量 (t=-115.21, P < 0.01) 也明显升高，神经功能评分亦明显下降 (t=105.77, P < 0.01)，但与SAH组相比其脑含水量明显下降 (t=75.67, P < 0.01)，神经功能评分明显升高 (t=-81.68, P < 0.01)。见表 1。

表 1 各组大鼠神经功能评分及脑含水量比较 (x±s)
组别 n 神经功能评分 脑含水量 (%)
对照组 6 17.29±1.00 74.02±0.45
干预组 6 13.20±0.87ab 78.05±0.68ab
SAH组 6 10.02±0.97a 81.19±0.73a
注：a为与对照组相比，P < 0.01；b为与SAH组相比，P < 0.01。
表选项
2.2 RT-PCR检测各组大鼠脑组织p38MAPK的mRNA表达水平

SAH组p38MAPK的mRNA表达水平较对照组明显增高，差异有统计学意义 (t=-24.75, P < 0.01)。干预组与对照组相比，p38MAPK的mRNA表达水平也明显升高 (t=-6.85, P < 0.01)，但与SAH组相比明显下降 (t=9.43, P < 0.01)。见表 2。

表 2 各组大鼠脑组织p38MAPK的表达比较 (x±s)
组别 n RT-PCR检测mRNA表达 免疫组化检测蛋白表达
对照组 6 0.400±0.063 0.17±0.41
干预组 6 3.299±0.521ab 1.17±0.41b
SAH组 6 1.891±0.386a 1.83±0.41
注：a为与对照组相比，P < 0.01；b为与SAH组相比，P < 0.01。
表选项
2.3 免疫组化检测各组大鼠脑组织p38MAPK蛋白表达

对照组未见明显染色，而SAH组及干预组均可见较多棕黄色染色 (图 1)。与SAH组相比，干预组p38MAPK的表达评分明显下降，差异有统计学意义 (t=-3.37, P < 0.01)(表 2)。

图 1 免疫组化检测各组大鼠脑组织p38MAPK蛋白表达 (SABC, ×200)。 注：A：对照组；B：SAH组；C：干预组。
图选项
3 讨论

SAH是一种神经系统急危重症，具有高死亡率及高致残率的特点[10]。传统观点认为，患者起病3 d后出现的脑血管痉挛是导致其不良预后的主要原因，但近年来研究发现，导致患者预后不佳的主要原因是EBI[1]。本研究中SAH组及干预组动物有神经功能明显缺失，脑含水量明显增加，提示有EBI形成。

EBI是指SAH后72 h内全脑组织所发生的直接损伤，涉及血脑屏障破坏、脑水肿及脑细胞凋亡等一系列病理事件[1]，其形成机制是多种因素共同参与的过程，其中炎症级联反应起主导作用[2]。SAH后的出血组织可作为抗原物质刺激炎症细胞，激活细胞内的信号途径，促使炎性介质基因转录与表达[11]，导致以白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6) 及肿瘤坏死因子-α(TNF-α) 为主的炎性介质大量释放，从而产生炎症级联反应并最终导致EBI形成[12]。p38MAPK在多种炎症反应中起关键作用，但既往有关p38MAPK在SAH后炎症反应中作用的研究主要集中于脑血管痉挛[13]，在EBI形成中的作用则鲜有报道。本研究中SAH组大鼠脑组织p38MAPK表达水平及脑含水量均较对照组明显增加，干预组在抑制p38MAPK的表达后其脑含水量即较SAH组明显减轻，表明p38MAPK在EBI的形成机制中起重要作用，而有关p38MAPK在SAH后不同时间点的表达时相及其参与调控EBI形成的具体机制则有待于进一步深入研究。

近年来，免疫机制探讨已成为防治EBI的研究热点[14]。p38MAPK是介导多种炎症反应细胞内信号转导的最终通路[15]，本研究结果表明，抑制p38MAPK表达可明显减轻大鼠SAH后EBI程度。因此，p38MAPK有望成为防治EBI形成的药物作用新靶点。

参考文献
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