2017, Vol. 44扩展功能
文章信息
- 崔新新, 董素艳, 郭彦杰, 赵文娟, 吴云成
- CUI Xin-Xin, DONG Su-Yan, GUO Yan-Jie, ZHAO Wen-Juan, WU Yun-Cheng
- MPTP小鼠脑沉默信息调节因子1和缺氧诱导因子-1α的表达及行为学检测
- Expression of silent information regulator 1 and hypoxia-inducible factor 1α and behavioral changes in MPTP mice
- 国际神经病学神经外科学杂志, 2017, 44(1): 28-34
- Journal of International Neurology and Neurosurgery, 2017, 44(1): 28-34
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文章历史
收稿日期: 2016-10-10
修回日期: 2016-12-30
2. 新乡医学院第三附属医院神经内科, 河南省新乡市 453003;
3. 上海交通大学药学院, 上海市 200240
帕金森病 (Parkinson’s disease, PD) 是中老年人中第二大常见的神经退行性疾病，在大于65岁的人群中，PD发病率接近1%[1]。尸检和致病基因的生物学效应等研究发现，线粒体功能异常、氧化应激、炎症及蛋白质处理异常等可能参与了PD的细胞功能异常和死亡机制[2]。但其具体发病机制尚未完全阐明。
沉默信息调节因子 (silent information regulation 2 homolog, SIRT)，是NAD+依赖性的Ⅲ型组蛋白去乙酰化酶 (HDACs)，包括SIRT1-7[3]。研究发现，SIRT1在大脑中高度表达，而PD细胞模型中其表达受损[4]，而SIRT1激活物可缓解多巴胺能神经元的损伤[5]；深入的机制研究发现，过表达SIRT1可通过激活分子伴侣，抑制α-突触核蛋白的聚集[6]。
缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1, HIF-1) 由HIF-1α和HIF-1β两个亚基组成，其中，HIF-1α含量受氧浓度调节[7]，缺氧状态下，HIF-1α的降解受抑制，与靶基因的缺氧反应元件 (hypoxia response element, HRE) 结合，促进靶基因转录[8]。研究发现多巴胺 (dopamine, DA) 合成关键酶酪氨酸羟化酶 (tyrosine hydroxylase, TH) 的启动子区域存在HRE可与HIF-1结合；条件性敲除小鼠的HIF-1α基因，可致黑质区域TH表达下调；低氧及去铁胺可以通过上调HIF-1，增加大鼠中脑TH的表达；而增加HIF-1的活性，可增加中脑黑质区域DA的合成和分泌[9]。之前研究显示，HIF-1α的稳定性和功能受翻译后修饰调控[9]，但具体机制尚未明确。
蛋白质的乙酰化修饰是机体中一种重要的翻译后修饰方式，可能参与HIF-1α的修饰调控。而SIRT1的保护作用，主要是通过对组蛋白和非组蛋白类转录因子的去乙酰化作用实现的，其中包括p53、FOXO和HIF-1α等[10, 11]。有研究显示，SIRT1可直接作用于HIF-1α 674位点赖氨酸、使其去乙酰化，减少含量及转录活性[12]。低氧抑制糖酵解时，发现HIF-1α和HIF-2α可以导致SIRT1表达上调[13]。肝癌细胞系内，下调SIRT1蛋白表达或抑制其活性后，则严重损害HIF-1α蛋白的积聚及其转录活性[14]。以上研究多集中在细胞水平，少见活体水平研究。本实验在动物活体水平探讨SIRT1与HIF1α在MPTP处理的小鼠中变化，探讨二者在PD发病过程中的变化，为阐明SIRT1/HIF-1α信号通路参与PD的发病机制提供实验依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物雄性C57BL/6小鼠，8~10周龄，体重24~28 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供 (生产许可证编号：SCXK (沪) 2012-0002)。小鼠每笼4~5只，自由进食和饮水，室温20~25℃，相对湿度40%~50%，12 h昼夜节律，饲养于上海交通大学实验动物中心 (使用许可证编号：SYXK (沪)2013-0052)。
1.2 实验动物分组给药雄性C57BL/6小鼠适应1周后，进行行为学训练1周，随机分为对照组和模型组，各10只。模型组小鼠腹腔注射MPTP (30 mg/kg, Sigma, USA)，对照组腹腔注射等量生理盐水，连续注射5 d。最后一次给药后21 d处死小鼠，取材，进行后续实验。
1.3 行为学实验在首次给药前1 d、及末次给药后第1、7、14、21 d分别进行行为学测试。各行为学测试重复一次，两次间隔1 h。
1.3.1 开场实验开场实验 (open field) 主要用于评价小鼠自发行为活动情况。将小鼠置于实验箱预订位置，摄像机连续拍摄5 min全程记录活动情况，开场实验视频分析系统 (上海移数信息科技有限公司) 分析其行走的总路程 (total distance)、中央活动路程 (center distence) 及运动轨迹等。同时，观察并计数小鼠全程中竖立次数 (rearing)。
1.3.2 足迹实验足迹实验 (stride length) 根据文献[15]实验装置是长55 cm，宽10 cm，高10 cm木制走道，一边盲端，另一边接黑色的鼠笼。实验时将小鼠放于盲端，光源照射走道，小鼠自然爬向鼠笼端。分别测量3个最长的前肢步长 (fore limb)、后肢 (hind limb)，取平均值。
1.3.3 爬杆实验爬杆实验 (pole test) 的装置[16]是长60 cm，直径约1 cm，上端覆以直径约2.5 cm的球形突起。实验时将小鼠头朝上置于球形突起，记录其自放置于杆顶到头转向下的时间 (T-turn) 和自放置杆顶至爬至杆底后肢着地的总时间 (T-total)。每只小鼠测试3次取平均值，每次间隔10 min以上。
1.4 小鼠心脏灌注及取材末次行为学检测结束后，小鼠心脏灌注取全脑用于组织病理学检测。按40 mg/kg腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，之后心脏灌流操作，断头，小心剥离全脑，置于4% PFA进行后固定24 h后，石蜡包埋，冠状位切6 μm切片，切片需包括完整的黑质致密部，用于免疫组织化学分析。每组另外5只颈椎脱臼处死，冰上迅速解剖黑质纹状体，液氮和-80℃储存，用于高效液相色谱或其他后续处理。
1.5 高效液相色谱检测神经递质取剥离纹状体称重，按10 μl/mg加入含有10 mM EDTA的PBS。冰上15 min，超声破碎组织。4℃，15000 rpm，离心10 min，取上清，记录样品上清量。上清中加入等体积含10 mM EDTA的0.4 M的冷冻HCLO4混匀。冰上避光静置15 min后，4℃，15000 rpm，离心15 min，取中间层进行高效液相色谱 (high performance liquid chromatography, HPLC) 电化学检测，检测DA及其代谢产物。
1.6 免疫组化脑组织的免疫组织化学检测酪氨酸羟化酶 (TH)、多巴胺转运体 (DAT)、SIRT1和HIF-1α。脑组织石蜡切片室温下0.3%过氧化氢孵育10 min，再放于封闭液 (含10%山羊血清、0.2% Triton X-100的0.01M PBS (pH 7.2))37 ℃封闭30min。切片用0.01 M PBS清洗3次，每次5 min。小鼠源性的一抗anti-TH、anti-DAT、anti-SIRT1 (Cell Signaling Technology, Inc. Danvers, MA, USA)，anti-HIF1α(Abcam, San Francisco, USA) 按抗体说明书稀释，4℃孵育过夜。第二日，生物素标记的抗小鼠IgG处理30 min，然后加亲和素-过氧化物酶复合物 (ABC kit, Vector, USA)。0.05%DAB (含0.03%H2O2的Tris-Hcl缓冲液) 显色。
1.7 蛋白质免疫印迹组织总蛋白分离和提取方法按照试剂 (sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA) 说明书进行，相同含量的蛋白质用SDS-PAGE进行分离，转移至PVDF膜上，经5%脱脂奶粉室温封闭45 min。PVDF膜分别置于特定一抗anti-SIRT1、anti-TH、anti-βActin (Cell Signaling Technology, Inc.Danvers, MA, USA)、anti-HIF-1α(abcom, San Francisco, USA) 稀释液中孵育，4℃过夜。第二日，PVDF膜用TBST漂洗3次，孵育二抗，孵育结束后TBST洗膜。NIR扫描设备 (Odyssey scanner, I-COR Bioscience) 检测免疫活性，Image J软件分析蛋白条带的灰度值。
1.8 RNA提取、反转录和qRT-PCR用Trizol reagent (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) 提取样品总RNA，测定提取RNA浓度。逆转录反应根据ReverTra Ace-α First Strand cDNA Synthesis Kit (TOYOBA CO, LTD) 的说明进行，反转录RNA样品为cDNA。利用SYBR-Green real-time PCR Master Mix (Toyobo Co., Ltd., Osaka, Japan)，以各组样品cDNA为模板，进行qRT-PCR反应。以18sRNA为内参，反应结束后，采用△△ CT法计算目的基因的相对含量。用于扩增的每个基因的引物序列如下：
HIF1α-F: GCGCGAACGACAAGAAA
HIF1α-R: GAAGTGGCAACTGATGAGCA
18s rRNA-F: CAGCCACCCGAGATTGAGCA
18s rRNA-R: TAGTAGCGACGGGCGGTGTG
1.9 统计学分析所有数据均用均数±标准差 (x±s) 表示。行为学数据的比较使用重复测量数据的方差分析 (one-way repeated measures ANOVA)，组间比较用单因素方差分析 (one-way ANOVA)，组内两两比较采用Dunnett’s T3检测或LSD法。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 MPTP处理小鼠表现出行为学异常为了检测MPTP对完整脑回路中多巴胺能神经元的影响，我们检测开场实验、足迹实验、爬杆实验，检测MPTP处理后小鼠运动功能改变。实验结果显示，模型组小鼠运动的总路程 (total distance)、中央路程 (center distence) 及竖立次数 (rearing) 在给予MPTP处理后第1、7、14、21天均较对照组小鼠显著下降 (图 1A~图 1C)。给予MPTP处理后，模型组小鼠前肢及后肢步长均较对照组小鼠显著缩短 (图 1F~图 1G)。模型组的转向时间 (T-turn) 及爬杆总时间 (T-total) 均较对照组小鼠显著延长 (图 1D~图 1E)。以上行为学的实验结果表明，MPTP能够明显诱导小鼠行为学损伤。
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| 图 1 MPTP对小鼠行为学、多巴胺及其代谢产物的影响 开场实验 (n=10)：检测竖立次数 (A)、总路程 (B)、中央路程 (C)；爬杆实验：检测爬杆总时间 (D)，转向时间 (E)；足迹实验 (n=10)：前肢步长 (F)，后肢步长 (G)。HPLC检测 (H-I) 纹状体中DA (J)、DOPAC (K) 和HVA (L) 的表达情况，即荧光强度 (fluorescence intensity)(n=5)。*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001均为与对照组比较。 |
为了明确MPTP对小鼠纹状体DA及其代谢产物的影响，我们选用HPLC检测小鼠纹状体多巴胺 (DA)、二羟基苯乙酸 (DOPAC) 及高香草酸 (HVA) 的含量 (图 1H~图 1L)。MPTP处理可以导致纹状体中DA含量显著下降 (对照组：100.00%±7.06%；模型组：47.83%±4.99%；P=0.0003; n=5)；多巴胺的代谢产物DOPAC (对照组：100.00%±8.02%；模型组：40.96%±1.97%；P < 0.0001; n=5) 以及HVA (对照组：100.00%±2.58%；模型组：62.62%±3.08%；P < 0.0001; n=5) 在MPTP处理21 d后同样显著下降。为了进一步检测MPTP对多巴胺能神经元的神经毒性损害，我们检测黑质致密部中TH和DAT阳性神经元含量。从图 2A~图 2D中我们发现，与对照组相比，MPTP降低了黑质中TH (对照组：17.26%±0.28%；模型组：10.82%±0.36%；P=0.0048, n=5) 和DAT (对照组：19.25%±0.34%；模型组：10.83%±0.16%；P=0.0020, n=5) 阳性神经元含量。
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| 图 2 MPTP对纹状体区域TH和DAT阳性神经元及TH蛋白表达的影响 纹状体区DA神经元TH (A和C) 和DAT (B和D) 染色的典型图片及相应的阳性神经元 (immupositive cells) 计数统计图。Scale bars: 20 μm。纹状体区TH蛋白免疫印迹图及灰度统计图 (E)，caspase 3和cleaved caspase 3蛋白免疫印迹图及相对表达 (relative expression) 灰度统计图 (G和H)。*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001均为与对照组比较 (n=5)。 |
采用免疫组织化学检测实验动物脑组织中SIRT1和HIF-1α的表达情况。如图 3A和图 3C，与对照组相比，模型组SIRT1阳性细胞明显下降 (对照组：5.10%±0.06%；模型组：3.12%±0.01%；P=0.0011; n=5)；相反的是，HIF1α阳性细胞数量较对照组增加 (对照组：5.17%±0.15%；模型组：8.06%±0.27%；P=0.0120; n=5)(图 3B和图 3D)。为进一步验证结果，采用蛋白印迹和qRT-PCR分别检测SIRT1和HIF-1α的蛋白质和HIF-1α mRNA的含量 (图 3E~图 3H)。与上述结果相一致，SIRT1蛋白表达下降，HIF1α的水平增加，同时，HIF-1α mRNA显著增加 (图 3H)。纹状体蛋白印迹分析结果显示，MPTP组中TH的蛋白质含量下降，凋亡相关的蛋白剪切形式的caspase3被激活，而总的caspase3未见明显变化 (图 2E~图 2H)。
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| 图 3 MPTP处理小鼠对SIRT1和HIF1-α表达影响 SIRT1(A和C) 和HIF-1α (B和D) 免疫组化染色的典型图片及相应的免疫阳性细胞 (immupositive cells) 定量统计图。Scale bars: 20 μm。纹状体区SIRT1和HIF-1α蛋白的免疫印迹分析 (E) 及相对表达 (relative expression) 灰度统计图 (F和G)。纹状体区HIF-1α mRNA qRT-PCR相对表达 (relative expression) 分析图 (H)。*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001均为与对照组比较 (n=5)。 |
目前有多种PD动物模型的建立方法。小鼠一般采用腹腔注射造模剂构建模型。常用药物有MPTP (30 mg/kg) 和百草枯 (10 mg/kg) 等。对于MPTP造模又分为急性、亚急性和慢性模型。慢性小鼠PD模型更适于研究药物的治疗效果[7]而急性模型多用于神经炎性和神经保护研究[17]。本研究中采用了亚急性造模方法，避免了急性造模时大剂量易致死的弊端，又避开了慢性造模时间过长混杂因素过多结果不稳定。PD病人主要临床特点为静止性震颤、运动迟缓、肌强直等[18]。本研究中，检测多种行为学指标：开场实验用于评估小鼠的自主活动状态，是检测MPTP损伤后小鼠少动的常用指标；足迹试验检测步态异常，爬杆试验用于评价运动迟缓。综合各指标证实MPTP模型小鼠表现出明显的自主运动异常，步态异常，运动缓慢。
最近研究表明，SIRT1和HIF-1α可能参与了PD的发生和发展。SIRT1在大脑中高度表达，PD细胞模型中其表达受损[4]，SIRT1激活物可对抗多巴胺能神经元的损伤[8]；其机制可能是激活分子伴侣，抑制α-共核蛋白的聚集[6]。HIF-1参与PD疾病发生主要涉及TH，因其启动子区域存在HRE可与HIF-1结合；条件性敲除HIF-1α基因，可致黑质区域TH表达受损；而条件性上调HIF-1，能增加大鼠中脑TH的表达；另外增加HIF-1的活性，也能增加中脑黑质区域DA的合成和分泌[9]。但两者间具体的调控机制尚不清楚。
有研究显示，在HT1080细胞中，SIRT1可直接作用于HIF-1α赖氨酸674位点、促进HIF-1α去乙酰化，增加其降解，降低其转录活性[12]。对多个细胞系的研究发现，低氧抑制糖酵解时，HIF-1α和HIF-2α可以导致SIRT1表达上调[13]。另有研究提示，SIRT1可以促进PHD去乙酰化，间接减少HIF-1α降解。有研究者发现，肝癌细胞系内，缺氧未改变SIRT1 mRNA或蛋白的表达，但可引起HIF-1α蛋白累积并上调其靶基因的表达，但下调SIRT1蛋白表达或抑制其活性后，则严重损害HIF-1α蛋白的积聚及其转录活性[14]。因此认为HIF-1α是SIRT1去乙酰化调控的下游靶标；缺氧条件下，SIRT1是HIF-1α蛋白积聚和激活其靶基因的必需条件[14]。另有研究对心肌细胞给予低氧预处理后，得出类似结论，SIRT1也可以通过去乙酰化PHD下调其表达最终升高HIF-1α水平[19]。最新报道，MPP+处理SHSY-5Y后，SIRT1表达下降，导致与HIF-1α启动子区域结合的组蛋白H3K14的乙酰化升高，激活HIF-1α的转录使其表达水平上调[20]。Lim等人发现SIRT1可结合并去乙酰化HIF-1α的第674位氨基酸，进而干扰其靶基因启动子区域招募辅因子p300，进一步抑制后者的转录活性[9]。SIRT1可以通过去乙酰化修饰下调脯氨酸羟化酶PHD2的表达，而抑制SIRT1后PHD2的表达上调，进而使HIF-1α降解增多，含量减少[21]。在几个不同的肿瘤细胞系中的研究均发现，SIRT1可以抑制HIF-1的活性[22]。以上研究揭示SIRT1和HIF-1间存在相互作用，可能涉及多种调控机制，但多数研究局限于体外实验，本研究在体内水平，探讨了二者在PD模型中的变化。为进一步深入了解二者间联系打下基础。
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