胶质瘤是神经系统发病率最高的肿瘤，约占神经系统肿瘤的40%~50%。由于其恶性增殖和侵袭性生长，复发率高，预后差、死亡率高。无论是手术治疗，还是放疗、化疗，都难以彻底治愈。因此，胶质瘤的治疗仍为医学难题之一。流行病学研究表明，脑胶质瘤患者中男女发病率的比例达到1.5~2：1^[1-3]，有明显的性别差异。近年来，在有性别差异的恶性肿瘤研究中，发现雄激素轴发挥了重要的作用。细胞色素P450c17a酶 (CYP17A1) 和雄激素受体 (androgen receptor，AR) 是雄激素轴的重要组成部分。本课题组前期就胶质瘤患者血清睾酮浓度进行了相关研究，结果表明男女胶质瘤患者术前明显高于对照组，术后相对于对照组血清睾酮浓度降低更为明显，且女性胶质瘤患者血清睾酮浓度变化更为明显^[4]。为进一步探讨雄激素合成关键酶CYP17A1及其受体AR在胶质瘤中作用，本研究通过免疫组化的方法检测CYP17A1蛋白和AR蛋白在胶质瘤中表达情况，并分析三者之间的关系，探讨雄激素轴在胶质瘤中的作用。

1 材料与方法 1.1 一般材料

收集2014年6月~2015年12月间安徽医科大学附属省立医院收治的55例脑胶质瘤手术切除标本，术前均未行放、化治疗，经病理确诊，有详细的临床和病理资料。根据WHO2007中枢神经系统肿瘤分类标准进行组织学分类及分级：WHOⅠ级2例，WHOⅡ24例，WHOⅢ11例，WHOⅣ18例，另外10列正常脑组织标本取自颅脑损伤行内减压术的患者，术后病理检查证实为正常脑组织无胶质细胞增生及坏死。本研究所用组织标本为经10%中性福尔马林标本固定液固定，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片5张，编码。

1.2 主要试剂

山羊抗人CYP17A1多克隆抗体 (美国Santa Cruz公司CYP17A1抗体N-17: sc-46084)，小鼠抗人AR单克隆抗体 (美国Santa Cruz公司AR抗体441: sc-7305)，山羊超敏二步法免疫组化检测试剂盒 (PV-9003)，小鼠超敏二步法免疫组化检测试剂盒 (PV-9002)，二氨基联苯胺 (diaminobenzidine，DAB) 显色试剂盒 (北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3 免疫组织化学染色二步法

石蜡切片经脱蜡、水化。抗原修复采用微波修复 (高火5分钟至沸腾，室温冷却)，进行3% H₂O₂去离子水孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶。PBS冲洗2分钟×3次，滴加CYP17A1/AR一抗 (1：300稀释)，4℃过夜。PBS冲洗2分钟×3次，滴加聚合物辅助剂，室温孵育10~20分钟。PBS冲洗2分钟×3次，滴加辣根酶标记抗山羊/小鼠IgG聚合物，室温孵育10~20分钟。PBS冲洗2分钟×3次，应用DAB溶液显色2~5 min。自来水充分冲洗，苏木素复染1~2 min，脱水，透明，封片。阴性对照组以PBS代替一抗。

1.4 结果判断

400倍光镜下观察，随机选取切片5个视野，计数1000个细胞中阳性染色细胞，阳性细胞率=(阳性表达细胞数/1000)×100%。无阳性细胞或阳性细胞数 < 1%为阴性 (-)，1 %~25%为弱阳性 (+)，26 %~50%为阳性 (++)，> 50%强阳性 (+++) ^[5]。

1.5 统计方法

使用SPSS 22.0软件进行统计学处理。采用卡方检验进行数据分析，等级资料的相关性采用Spearman秩和检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 CYP17A1蛋白在胶质瘤组织中表达情况

免疫组化检测CYP17A1蛋白表达，显示在胶质瘤各病理级别标本均呈阳性表达，正常脑组织不表达。且CYP17A1蛋白的表达在高级别胶质瘤标本 (WHOⅢ级和WHOⅣ级) 和低级别胶质瘤标本 (WHOⅠ级和WHOⅡ级) 间有统计学差异 (χ²=12.034，P < 0.05)。经Spearman相关分析，CYP17A1蛋白的表达与病理级别呈正相关 (r=0.705，P < 0.05)，具体内容见图 1，表 1、2。

2.2 AR蛋白在胶质瘤组织中的表达情况 (见图 2)

免疫组化检测AR蛋白在胶质瘤各病理级别标本均呈阳性表达，正常脑组织不表达。且AR蛋白的表达在高级别 (WHOⅢ级和WHOⅣ级) 胶质瘤标本和低级别 (WHOⅠ级和WHOⅡ级) 胶质瘤标本间有统计学差异 (χ²=19.509，P < 0.05)。经Spearman相关分析，AR蛋白的表达与病理级别呈正相关 (r=0.73，P < 0.05)，具体内容见图 2，表 3、4。

3 讨论

CYP17A1全称为cytochrome P450, family 17, subfamily A, Polypeptide 1(细胞色素P450c17)，基因位于第10号染色体 (10q24.3)，也被称为17α-羟化酶，17、20-裂解酶。主要定位于细胞内质网及微粒体，是胆固醇合成睾酮过程中的两个关键酶。研究表明CYP17A1的多态性与一些性别相关恶性肿瘤的发生发展密切相关^[6]。

AR是雄激素轴中重要的受体，主要表达于细胞核内。AR基因定位于X染色体 (Xql1.2-12)，并通过与靶基因结构上特殊的序列结合，即与雄激素反应元件 (androgen response element，ARE) 结合，进一步调控靶基因的表达^[7]。在一些恶性肿瘤的研究中，AR的表达是这些恶性肿瘤的发生发展及性别差异的重要原因^{[8, 9]}。Ceccarelli等^[10]研究发现加入雄激素的培养基能促进胶质瘤细胞的增殖。Hopewell等^[11]应用3，4-苯芘并诱导脑胶质瘤大鼠模型的研究中发现，雄性大鼠胶质瘤诱导成功率为77.8%，而对照组去势雄性大鼠胶质瘤诱导率明显低下，仅为50%，且对照组的中位生存期也明显延长。裸鼠皮下胶质瘤模型研究^[12]也得出相似的结果，雄性裸鼠肿块生长速度明显快于雌性裸鼠。本课题组前期研究发现胶质瘤患者血清睾酮浓度明显高于对照组^[4]，雄激素受体在胶质瘤组织中呈过表达状态，且睾酮受体的表达与胶质瘤的级别呈正相关^[13]。

本研究发现CYP17A1蛋白和AR蛋白在脑胶质瘤组织中表达明显高于正常组织，且CYP17A1蛋白和AR蛋白表达情况随着胶质瘤病理级别的增高而增强。说明胶质瘤能通过过表达CYP17A1蛋白等睾酮合成过程中的关键酶，增加的睾酮底物向睾酮的转化，从一个方面解释了胶质瘤患者血清睾酮水平高于正常人平均水平^[4]。而在一些性别相关恶性肿瘤的研究中发现，雄激素能促进AR蛋白的表达^[14]。由此推测胶质瘤细胞过量转化的睾酮等雄激素可能进一步促进了AR等雄激素受体的表达。而过表达的AR等雄激素受体，可能又增强了雄激素对胶质瘤细胞的多种生物学作用。在前列腺癌的研究中发现，雄激素与AR结合，进一步激活了Src/Raf/ERK信号传导通路，有效的维持了前列腺癌细胞的致瘤性^[15]。本课题研究结果发现胶质瘤组织内雄激素合成的关键酶CYP17A1与雄激素受体AR二者均呈阳性表达，且表达与病理级别密切相关，提示胶质瘤组织内存在着睾酮-睾酮受体自分泌环路，并与胶质瘤的发生发展及预后有着密切的联系。

综上所述，CYP17A1蛋白和AR蛋白在胶质瘤组织中的表达明显升高，且随病理级别升高而表达增强，表明胶质瘤内部的雄激素轴与胶质瘤的发生有着密切的联系。但是，雄激素轴在脑胶质瘤中的作用通路仍需进一步研究。这将为胶质瘤的内分泌治疗与临床诊断展开了新的道路。