急性中枢神经系统(central nervous system，CNS) 损伤包括创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI) 和非创伤性脑损伤，非创伤性损伤范围较广，本文专指血管病导致的损伤如出血性卒中、缺血性卒中和蛛网膜下腔出血等。急性CNS损伤是造成机体死亡和长期残疾的主要原因，给社会带来了巨大负担^[1]。尽管已有海量研究，并开展了大量治疗实验，但目前还没有公认安全有效的疗法^[2]。因此，寻找促进修复急性CNS损伤的新疗法，是临床神经科学领域的主要任务。越来越多的研究显示，外泌体有望成为诊疗CNS损伤的有效疗法。

1 外泌体简介

1983年，外泌体在绵羊网织红细胞中被首次发现。Johnstone首先分离出这些囊泡并发现它们含有多种活性酶，将其命名为外泌体。它是直径为30~120 nm的小囊泡，可被所有类型的细胞(正常或病理状态) 分泌，并且在血液、唾液、尿液和乳汁等生物流体中的含量都很丰富^[3]，每微升血清中大约有3×10⁶外泌体^[4]。它是在体内不同位置之间运送货物的载体^[3]，非常适合小功能分子的传送，在细胞间的信息交流中起到主要作用^[5]。并且参与了机体的免疫应答、抗原提呈、炎症反应、细胞迁移及分化、肿瘤侵袭、细胞凋亡和血管生成等过程^[6]。它不仅含有蛋白质、脂类和mRNA，还带有非编码RNA，包括miRNAs、Piwi相互作用RNAs (Piwi-intercting RNAs, piRNAs)、长链非编码RNAs (long non-coding RNAs, lncRNAs) 和环状RNAs (circular RNAs, cicRNAs) 等^[7、8]。而含有22~25个核苷酸的miRNAs，可以调节基因表达并在中介生物学功能方面发挥重要作用。研究者已经认识到，通过改变外泌体内调节基因表达的通信指令，有望达到治疗癌症与神经系统疾病的目的^[4]。

外泌体及其所携带的物质反映了它们来源细胞的生理状况及其所处的环境条件^[4]，它的组成和功能取决于其母细胞^[9]，具有高度的细胞起源依赖性^[10]。当外泌体被宿主细胞分泌到受体细胞中时，不仅其携带的蛋白质和脂类可直接发挥生物活性、mRNA可被翻译成蛋白质，随其转移的miRNAs也同样具有活性，可靶向调节受体细胞中mRNA的水平。传统认识是，由于体积很小或特异受体介导的内化，细胞分泌的信号分子是通过被动扩散进入受体细胞的。而新证据发现，外泌体可以主动向受体细胞发送更加复杂的“信息”。这些纳米级的囊泡(外泌体) 就像病毒一样，能够轻松地从一个细胞转移到另一个细胞并且穿过细胞膜卸载其内容物^[3]。

分离外泌体的传统方法是超速离心法和蔗糖密度梯度离心法，但这些方法步骤繁琐且浪费时间，难以应用于大规模工业生产^{[11, 12]}。Kim等^[13]使用可扩大生产且高效的色谱法分离外泌体，他们发现多能间充质干细胞(multipluripotent mesenchymal stromal cells, MSCs) 来源外泌体的表面抗原决定簇CD63和CD81阳性率高于80%，并表达了高水平的肿瘤坏死因子诱导蛋白6(tumor necrosis factor-stimulated gene 6 protein, TSG-6)。TSG-6被证明与抑制TBI小鼠模型的神经性炎症高度相关。接下来需要进一步确定促进神经损伤修复的外泌体所表达的特异抗原，利用这些抗原，可以通过免疫亲和层析法提取高度特异性的目标外泌体。

2 外泌体用于急性CNS损伤的诊断

CNS损伤患者会出现各种各样的症状及影像学特点，临床上很难准确鉴定其损伤程度和监测治疗反应，神经组织活检又有多种条件限制，因此特别需要神经损伤相关的特异生物标记物来反映其病理生理机制和预测神经功能恶化的风险^[7]。Chen等^[16]确定了肺癌、结直肠癌和糖尿病患者血清miRNAs的特异表达形式，证明血清miRNAs包含了各种疾病指纹。脑肿瘤患者外周血中共同存在脑源性外泌体、tau蛋白和β-淀粉样蛋白等物质。然而，游离蛋白质和核酸标志物在循环血中极不稳定，且通常在重度神经损伤时才能检测到。而外泌体具有许多优于其它标记物的特性，如可以稳定存在于循环中、能在早期阶段检测到、存在于容易获得的生物流体(血液和脑脊液等)、来源于特定细胞并且容易准确量化^{[6, 7]}。

外泌体携带的非编码RNA (包括miRNAs) 在维持健康与疾病进展方面起到调节作用^[14]。Yuan等^[15]证实，干细胞通过外泌体转移了miRNAs给靶细胞，并改变了它的基因表达。特定的miRNAs与神经障碍的发展有关，导致了TBI并发症的发生和进展^[17]。Taylor等^[7]证明IL-1β等促炎性细胞因子是由损伤相关单核细胞来源的特定外泌体诱导产生的，神经损伤后的24小时内在循环和脑脊液中明显增加。另外，脑脊液IL-1β已被证明在高颅压和预后不佳的严重CNS损伤中水平最高，所以这些外泌体携带的物质可能具有预测价值^[18]。随着科技进步，受伤脑组织来源外泌体携带的特异miRNAs及其它物质，或许可作为稳定且非侵入性的生物标志物用于临床诊断、监测疗效和评估预后。

3 外泌体用于急性CNS损伤的治疗

最近十年多项研究表明，MSCs治疗神经损伤实验模型非常有效，具有潜在的临床应用价值^[12、19]。虽然它具有很好的治疗前景，但是也存在一些问题:只有一小部分移植的骨髓MSCs能够存活，且最终只有更少数的在损伤脑组织处分化成神经细胞；只可以将少量的MSCs直接注入颅内；动脉注射可引起脑缺血；而静脉注射又会导致体内广泛分布^[20]。并且Chopp等^[21]证明，骨髓MSCs参与大脑重塑和功能恢复的主要机制是其旁分泌效应而不是细胞替代作用。在用骨髓MSCs治疗脑卒中大鼠的实验中证实，干细胞通过分泌外泌体转移了miRNAs到脑实质细胞中，而后这些miRNAs调节了受体细胞多种基因的表达^[22]。与移植外源性MSCs不同，MSCs来源的外泌体不会增殖、低免疫原性(异体来源的外泌体可能也是安全的^[4])、更容易传递和存储(存储在-80℃的外泌体超过两年都不会失去生物活性^[3]) 并且可以通过药物途径(静脉注射或吸入给药等) 穿过血脑屏障^[23]。所以，使用MSCs来源的外泌体比直接移植MSCs治疗神经损伤更加安全有效且方便易行。Zhang等^[10]证明了:将来源于MSCs的外泌体以尾静脉注射的方式治疗TBI大鼠，显著增加了病变边界区和齿状回新生内皮细胞的数量、提高了齿状回新生未成熟及成熟神经元的数量、促进了基质重塑，还减少了神经性炎症。经过治疗，TBI大鼠的空间学习和记忆能力及感觉运动功能均得到了恢复，展示了该疗法对神经血管重塑和神经功能恢复的促进作用^{[10, 12]}。另有研究显示，外泌体还促进了轴突生长和突触形成^[24]。因此，外泌体或许可能成为一种临床治疗急性CNS损伤的有效方式。

研究表明，神经损伤会同时影响整个机体的不同分子途径^[25]。这种身体器官间的多靶向通信是通过释放微泡来实现的。脑损伤会刺激实质细胞和血管细胞释放外泌体，而外泌体所包含的miRNAs信息等内在成分则可被损伤刺激和分子微环境的变化所修改。随着这些外泌体通过血管系统被传送到身体的各个部位，体液的流动促进了活跃的信息交流。miRNAs的存在就像打开了分子开关，引起了对于疾病和损伤的各种生物反应^[4]。而miRNAs相互之间以及对转录因子会产生影响，从而形成一个生物网络，通过级联放大作用一个事件便会唤起众多反应。通过转染来改变骨髓MSCs的特异性miRNAs，产生的含有特异miRNAs的外泌体也就相应的有了特殊功能^[26]。由于进入到血液中的miRNAs如果没有外泌体包裹，将被核糖核酸酶迅速(几个小时) 降解，而包含在外泌体中的miRNAs即使在室温下也非常稳定(几天) 不会被降解^[27]。因此，外泌体在神经损伤修复中发挥了关键作用。外泌体促进TBI后功能恢复的作用机制尚不完全清楚。需要进一步的研究来确定外泌体中促进神经损伤后血管和神经再生的分子成分，包括特定的miRNAs和生长因子。一旦知道治疗中所必需的特定分子，就可以选择性促进这些分子的表达来提高治疗效果^[10]。另外，迄今为止进行的实验都使用的是来源于同一病人的外泌体^[3]，还不能确定同种异型个体亦或者异种生物的外泌体用于治疗患者是否安全，以及能否人工合成符合特定需要的外泌体？现在大多数关于外泌体小分子RNA的研究都局限于miRNAs，然而随着测序技术的进步，我们认识到还有许多其它的小RNA存在于外泌体中，包括piRNAs、lncRNAs和circRNAs等^[7]。现已证明胃癌组织中有piRNA-651和piRNA-823异常表达^[28]，所以这些小RNA的功能值得关注。另外，多数研究只关注外泌体本身，而忽视了其它体液成分，还有必要弄清楚，除了MSCs来源的外泌体外，其它细胞(如胚胎干细胞) 来源的外泌体以及其它细胞有机成分，是否也具有促进急性CNS损伤修复的作用^[10]？骨髓MSCs是否可能通过刺激肺巨噬细胞和脾T细胞对中枢神经系统产生远程系统效应^[29]？而如今需要回答的最基本问题是：是否高剂量的外泌体能够更好的促进急性CNS损伤后功能的恢复^[10]?

4 总结

外泌体广泛存在于血液和尿液等生物流体中，并且非常稳定。它含有各种疾病指纹，在急性CNS损伤后促进了神经血管重塑和神经功能恢复，展现出了应用于临床诊疗的极大潜力。但是，其具体作用机制和效应分子，以及特异外泌体的提取和制备等问题尚需进一步研究。随着对外泌体更加深入的认识，急性中枢神经损伤领域可能诞生革命性的新疗法。