survivin蛋白是细胞凋亡网络激活后产生的关键抗凋亡蛋白，它通过抑制病变组织中Caspase-3蛋白水解酶的作用，切断凋亡下游通路，发挥抗凋亡作用。miR-34a是一种已经被证实的促凋亡微小RNA^[1]，实验证实，癫痫持续状态后大鼠海马神经元中miR-34a的表达显著高于正常，造成海马区神经元的大量凋亡^[2]。国内外均有文献^[3]提示survivin可能是miR-34a的靶基因，miR-34a通过负性调控survivin蛋白的生成，调控细胞凋亡的病理生理过程：Cao等^[4]研究发现，胃癌细胞系HGC-27的miR-34a的表达水平明显低于正常细胞，促进了HGC-27细胞系的凋亡；进一步研究发现转染了miR-34a的HGC-27细胞survivin基因的表达明显低于未转染细胞，证明miR-34a通过靶向调控survivin的表达来调控胃癌细胞的凋亡过程。胡猛等^[5]发现向肝癌细胞株HepG2转染miR-34a后，HepG2细胞的survivin蛋白表达下调，凋亡细胞增加。

脑缺血-再灌注后，缺血半暗带的神经元迟发性死亡(delayed neural death,DND)是导致病情加重、恶化的重要因素，细胞凋亡是DND的主要形式。在上述文献证据的支撑下，我们推测：脑缺血再灌注损伤后，缺血敏感区脑组织高表达miR-34a，导致survivin蛋白的产量下降，是造成缺血区脑细胞凋亡的机制之一。来自基础实验及临床研究的大量资料证实干细胞移植对缺血性脑损伤具有保护作用^{[6, 7]}，但其发挥神经保护作用的具体机制尚不完全清楚。干细胞移植的神经保护作用机制是否与调节miR-34a及survivin蛋白的生成有关？本实验通过研究干细胞移植对缺血再灌注损伤大鼠脑组织miR-34a及survivin表达的影响，探讨干细胞移植的抗凋亡和神经保护作用。

1 材料和方法 1.1 动物及试剂

生长45～55 d左右的健康雄性SD大鼠192只，体重约250～300 g左右，由南华大学动物实验部提供。

RNAstore试剂、TRNzol-A+总RNA提取试剂、FastQuant cDNA第一链合成试剂盒、miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒均购至天根生化科技有限公司；miR-34a的引物序列为F Primer: AGCCGCTGGCAGTGTCTTA、R Primer: CAGAGCAGGGTCCGAGGTA，内参U6的引物序列为F Primer: ATTGGAACGATACAGAGAAGATT、R Primer: GGAACGCTTCACGAATTTG，引物、内参U6、目的茎环引物均由上海吉码制药有限公司设计合成，并且经过验证、商品化、已经通过多个科研机构使用和认可；兔抗鼠survivin抗体(一抗)、免疫试剂盒(带DAB，二抗)由武汉博士德生物工程有限公司生产；骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)由南华大学附属第二医院生物细胞中心惠赠。

1.2 方法 1.2.1 动物模型的制备及成功模型的判定

采用文献中描述的改良Longa线栓法^[8]创建大鼠大脑中动脉闭塞(middlecerebral artery occlusion,MCAO)再灌注模型。采用5分制评分法对造模后的大鼠进行评分：无神经损伤症状(0分)；不能完全伸展对侧前爪(1分)；向对侧转圈(2分)；向对侧倾倒(3分)；不能自发行走，意识丧失(4分)。评分为0分和4分的大鼠排除出实验，评分为1～3分的大鼠为造模成功模型。

1.2.2 实验分组及处理

随机将大鼠分为4组：空白组、模型组、PBS液移植组和干细胞移植组。空白组：接受造模过程中的皮肤切开，分离暴露颈动脉等手术操作，但不行动脉栓塞；模型组：参照文献复制^[8]MCAO模型，造模成功后，不做其他处理；PBS液移植组：MCAO造模成功后6 h经尾静脉注射PBS液(1 ml)；干细胞移植组：造模成功后6 h采用尾静脉注射法移植BMSCs(1 ml，含1×10⁶个干细胞)。各组分别于缺血-再灌注后12 h、1 d、3 d、7 d进行相应指标的观测。

1.2.3 尾静脉注射方法

PBS液移植组和干细胞移植组在造模成功后6 h，将大鼠置于固定器内，露出鼠尾，热水浸泡及酒精涂擦处理后，选择一条扩张最明显的尾静脉作为穿刺静脉。

1.2.4 神经功能缺损评分

参照改良大鼠神经功能缺损评分(Modified Neurological Severity Score,mNSS)细则对实验大鼠的神经功能进行评分，最大分值18分。

1.2.5 动物处死及标本的制备

四组大鼠于各观测时间点随机抽取6只，腹腔注射3%戊巴比妥钠(1 ml/kg)行腹腔注射麻醉。用于PCR检测的大鼠直接断头取脑，在冰面上分离右侧缺血区脑组织，置于去酶EP管中，加入10倍体积的RNAstore，于4℃浸泡过夜后，转入-20℃冰箱中长期保存；用于制备免疫组化切片的大鼠麻醉后，开胸暴露心脏，右心耳剪口，左心室内穿刺进针，快速灌注生理盐水200 ml后，继续灌注4%多聚甲醛约300 ml，大鼠四肢强直后拔出穿刺针，迅速断头，取出完整脑组织浸泡于4%多聚甲醛中固定24 h，用于制备石蜡切片。

1.2.6 免疫组化检测survivin蛋白

脑组织经甲醛固定，常规石蜡包埋，以缺血灶为中心连续冠状切片，脱蜡、水化，微波加热修复后，滴加山羊血清封闭20 min，继之滴加一抗4℃孵育过夜。滴加SABC液37℃孵育30 min后，DAB显色、苏木精复染、梯度脱水、封片、显微镜下观察计数阳性细胞数并拍片。

1.2.7 实时荧光定量PCR检测microRNA-34a

脑组织于液氮中研磨成粉状，以每30～50 mg组织加入1 ml TRNzol-A⁺的比例加入TRNzol-A⁺混匀，经异丙醇沉淀后获得总RNA；根据第一链合成试剂盒的操作步骤逆转录合成cDNA第一链；根据荧光定量检测试剂盒的操作说明行荧光定量检测，所使用的引物及内参U6由上海吉码制药有限公司设计合成。采集荧光数据后，使用2-^ΔΔCT法计算microRNA-34a的相对表达量。

1.3 统计学分析

使用SPSS 20.0统计软件处理数据。用均数±标准差(x±s)表示计量资料，正态性及方差齐性检验用K-S、Levene检验；均数的比较，多组间用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两组间比较用LSD-t检验；总体率的比较用χ²检验。设а=0.05为检验标准，当P<0.05时认为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 神经功能缺损评分

模型组、PBS液移植组和干细胞移植组在各时间点神经功能缺损评分均高于空白组(P<0.01)；模型组与PBS液移植组神经功能缺损评分在各时间点差异无统计学意义(P>0.05)；12 h、1 d时干细胞移植组与模型组、PBS液移植组神经功能缺损评分比较差异无统计学意义(P>0.05)；3 d、7 d时干细胞移植组神经功能缺损评分明显低于模型组和PBS液移植组(P<0.05)。见表 1。

2.2 免疫组化检测survivin的表达

模型组、PBS液移植组和干细胞移植组在各时间点survivin表达均明显高于空白对照组(P<0.01)；模型组在各时间点survivin表达与PBS液移植组比较差异无统计学意义(P>0.05)；干细胞移植组在各时间点survivin表达均显著高于模型组和PBS液移植组(P<0.05)。见表 2、图 1、图 2。

2.3 实时荧光定量PCR检测miR-34a的表达

模型组、PBS液移植组和干细胞移植组在各时间点脑组织miR-34a相对表达量均明显高于空白对照组(P<0.01)；模型组在各时间点脑组织miR-34a相对表达量与PBS液移植组比较差异无统计学意义(P>0.05)；干细胞移植组在各时间点脑组织miR-34a相对表达量均显著低于模型组和PBS液移植组(P<0.01)。见表 3、图 3。

3 讨论

大量研究资料证实干细胞移植对脑缺血-再灌注损伤具有保护作用，其可以通过修复替代受损神经元、改善病灶局部微环境等^[9-11]众多机制发挥神经保护作用。我们的实验数据显示，干细胞移植组3 d后的神经功能缺损评分明显低于模型组，再次证实干细胞移植可改善脑缺血-再灌注大鼠的神经功能，对缺血性脑损伤具有一定的保护作用。但是通过横向比较干细胞移植对神经功能缺损评分、survivin蛋白、miR-34a表达的影响，我们发现，干细胞移植组与模型组、PBS液移植组比较，神经功能缺损评分在12 h、1 d均无明显差异，直到3 d时才出现显著性下降，这与以往研究者得出的结论一致^{[12, 13]}，但是survivin蛋白及miR-34a的表达从12 h开始各实验组就出现了显著性差异。出现神经行为学症状的改变滞后于脑组织内代谢物质变化的原因可能是，疾病症状的恢复涉及体液及病灶微环境的改善、细胞功能的修复、缺失细胞的再生替代等诸多机制，因而滞后于分子生物学水平所检测的单一观测指标的改变。

促凋亡miR-34a是否参与脑缺血-再灌注损伤这一病理生理过程，目前国内尚未有文献报道。我们的实验结果显示在缺血-再灌注损伤后miR-34a的表达量明显升高，证实了miR-34a参与了脑缺血-再灌注这一病理生理过程。分析各实验组的数据结果，模型组miR-34a及survivin蛋白的表达水平均明显高于空白组，说明缺血-再灌注损伤后，脑组织中的促凋亡通路及抗凋亡通路均处于激活状态；干细胞移植干预使miR-34a的表达下调后，survivin蛋白的表达水平升高，表明survivin蛋白的表达水平与miR-34a的表达水平呈负相关关系。干细胞移植干预后，促凋亡miR-34a的表达量下降，抗凋亡survivin蛋白的生成量相应增多，最终大鼠的神经功能缺损评分明显下降，提示移植干细胞可能通过下调病灶区miR-34a、上调survivin蛋白的表达发挥抗凋亡作用。

但上述结论仅是我们研究的初步成果，需要进一步通过荧光素酶和β-gal双荧光报告系统检测miR-34a对survivin是否存在靶向调控作用，从而阐明miR-34a能否通过靶向调控survivin蛋白的表达实现对缺血-再灌注损伤后神经元迟发性死亡进行调控。