胶质瘤是发病率最高的原发性脑肿瘤，包括多种组织类型和不同恶性程度。分子神经肿瘤学的发展促使脑肿瘤的神经病理学诊断不再局限于提供肿瘤组织学类型和恶性级别的信息，取而代之的是临床相关的分子检测。O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O⁶-methylguanine DNA methyltransferase,MGMT)位于10号染色体q26，编码DNA修复酶，该酶可以移除鸟嘌呤O⁶基团的烷基^[1]。由于鸟嘌呤O⁶烷基化导致的双链分解和错配，进而诱导细胞凋亡。约35%~45%的恶性胶质瘤(WHO III级和IV级)和80% WHO II级胶质瘤存在MGMT启动子甲基化现象。生存期较长的胶质母细胞瘤患者，易发生MGMT启动子甲基化^{[2, 3]}。MGMT启动子甲基化状态可预测服用烷化剂药物的胶质母细胞瘤患者生存期的独立因子^{[4, 5]}。

本研究拟通过MS-HRM定量检测MGMT基因启动子甲基化，以期建立一种高效、准确和便捷检测胶质瘤MGMT基因启动子甲基化的方法，为胶质瘤患者个体性化疗提供参考。

随机从兰州大学第二医院神经病学研究所标本库中选取胶质瘤石蜡标本37例，所选标本均经过临床诊断和病理科证实。

QIAamp-DNA-FFPE-Tissue-Kit(QIAGEN，德国)，Bisulfite-Kit(QIAGEN，德国)，PCR-Control-DNA-Human(QIAGEN，德国)，HRM-PCR-Kit(QIAGEN，德国)，Nanodrop2 000(Thermo，美国)，Roto-gene6 000(Corbett，澳大利亚)。

使用QIAamp-DNA-FFPE-Tissue-Kit试剂盒从石蜡包埋组织提取DNA。采用Nanodrop 2000测定DNA浓度，并定量至5 ng/μl，至于-20℃冰箱待用。

取上述DNA样本1 μg使用 CpGenome甲基化试剂盒，按照Bisulfite-Kit试剂盒说明书进行甲基化修饰，之后用Nanodrop 2000定量至5 ng/μl。

使用MethyPrimer软件设计MGMT基因启动子区引物(表 1)，并由生物工程(上海)股份有限公司合成。

反应条件：95℃预变性15 min；95℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 45 s，40个循环。PCR结束后，取反应产物8μl行琼脂糖凝胶电泳，之后在凝胶成像系统下扫描成像。甲基化与否的评价标准：若基因启动子发生了甲基化，则用甲基化特异性引物可扩增出相应大小的条带；若未发生甲基化，则用非甲基化特异性引物可扩增出相应大小的条带；若基因启动子同时发生甲基化和未发生甲基化，则用甲基化特异性引物和非甲基化特异性引物可同时扩增出相应大小的条带。

PCR 反应体系为：总反应体积为25 μl，2×HRM PCR Master Mix 12.5 μl，上、下游引物各1.9 μl，DNA模板2 μl，灭菌水补足25 μl。反应程序：预变性 95℃ 5 min；扩增95℃ 10 s，60℃ 15s，72℃ 25s，共50个循环；熔解95℃ 1min，40℃ 1min，65℃ 1s。HRM条件为：95℃ 2min，40℃预处理2min后，Tm 72℃～90℃，每升高0.1℃采集1次数据。以 Cp Genome universal methylated作为100%甲基化的标准品，以100%非甲基化的健康人组织DNA作为稀释剂，将两者浓度调至相同水平，按不同比例分别配成甲基化程度为100%、50%、25%、10%、5%和0%系列浓度的标准曲线。用HRM方法检测0~100%标准品得到的荧光信号的强度。据此建立标准曲线。同时以修饰后标本的DNA为模板，用上述相同方法检测，根据待测标本在标准曲线上的位置判定其甲基化程度。每份标本重复检测3次，最后结果为其平均甲基化程度。

用SPSS 10.0 软件进行统计学分析，两组间比较t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果显示在37例标本中，发现甲基化标本5例(13.5%)，未甲基化标本3例(8.1%)，而部分甲基化标本29例(78.4%)(图 1和表 2)。

图 1 MSP检测胶质瘤标本MGMT启动子甲基化。标本G31、G127、G47和G72甲基化和未甲基化条带同时出现，属部分甲基化，而G82和G75只出现甲基化条带，属完全甲基化。“M”表示甲基化，“U”表示未甲基化。

图选项

成功建立了甲基化标准品HRM曲线(图 2)，待测样本在标准曲线上的位置表示其MGMT基因启动子甲基化程度(图 3)。MSP检测的3例未甲基化标本，经MS-HRM检测发现MGMT基因启动子甲基化水平在0%~5%和5%~10%分别有2例和1例。在所检测的标本中MGMT基因启动子甲基化水平在10%~25%和25%~50%的分别有14和17例(表 3)。

图 2 甲基化标准品高分辨率熔解曲线图。从左至右依次为0%、5%、10%、25%、50%和100%甲基化。

图选项

图 3 G111号标本MGMT基因启动子甲基化标准品高分辨率熔解曲线图。G111启动子甲基化水平在25%~50%区域。

图选项

MGMT基因启动子区CpG岛甲基化导致该基因失活，这涉及表观遗传学基因沉默^[6]。接受TMZ/RT治疗且MGMT启动子区甲基化的患者，中位生存期和两年生存率分别是22个月和46%。而接受同样治疗方法MGMT启动子区未甲基化的患者中位生存期和两年生存率分别是13个月和14%。MGMT启动子甲基化的老年患者(＞65岁)服用TMZ总生存期有所延长，而未甲基化的患者单独放疗效果更明显。对老年患者来说，MGMT启动子甲基化状态是用于个体治疗的重要生物标记^{[7, 8]}。因此，MGMT启动子区甲基化与胶质瘤患者生存期和生存率密切相关，有必要建立一种高效检测胶质瘤MGMT启动子甲基化的方法，以指导患者进行个体化治疗。

本研究发现胶质瘤组织中有3例标本采用MSP方法未能检测到MGMT基因甲基化。用MS-HRM方法进一步检测发现，这3例标本甲基化水平在0%~5%和10%~25%区域的标本分别有2例和1例。该结果表明这3例标本中MGMT启动子甲基化水平很低，MS-HRM法比MSP法有更高的灵敏度。MSP需两对已知的关键性CpG位点设计上、下游引物，并且这些位点必须完全甲基化或完全不甲基化，满足该条件的基因数目不多，具有明显的基因“选择性”。同时，MSP检测灵敏度约为10%，只能粗略定量基因启动子甲基化程度，临床诊断的意义较低，结果重现性差。与MSP方法相比，MS-HRM分析引物侧翼序列上所有甲基化位点，简单、准确和快速地实现定量分析。MS-HRM检测低达0.1%的基因启动子甲基化和分析出1bp的差异^{[9, 10]}。

MS-HRM对PCR产物没有破坏性，还能进行测序等后续分析^[11]。此外，MS-HRM建立标志曲线后，可以进行高通量分析基因启动子甲基化，效率提高，费用降低，适合于临床检测。而其他检测基因启动子甲基化的方法如测序和质谱存在设备要求高、操作繁琐和成本高等弊端。

本研究建立的MS-HRM定量检测MGMT启动子甲基化的方法，适用于临床高通量检测胶质瘤MGMT启动子甲基化水平，有利于指导胶质瘤患者合理选择用药。