高迁移率族蛋白 1(high-mobility group box 1,HMGB 1)是一种高度保守的非组DNA结合蛋白，具有稳定核酸结构、调节转录和基因表达等多种生物学功能。近年来发现在一定因素作用下其可以释放到细胞外发挥促炎因子作用。HMGB 1可由坏死细胞被动释放或由活化的免疫细胞主动释放，通过与其受体如Toll样受体4(toll-like receptor-4,TLR4)，Toll样受体2(TLR2)和晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end products,RAGE)等结合，激活核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)及其他信号传导通路，促进炎症因子及趋化因子的产生，从而发挥其促炎作用^{[1, 2]}。既往动物试验表明HMGB 1参与了脑缺血、脑外伤、脑炎等疾病的病理生理过程^{[3, 4, 5]}。而甘草酸被作为HMGB 1的高选择性抑制剂给予上述模型干预，可以有效减轻炎症反应以及血脑屏障破坏，发挥一定的脑保护作用^{[3, 6, 7]}。

近年来的研究表明，痫性发作与炎性反应密切相关。越来越多的实验室癫痫模型和切除的人类脑组织中发现，癫痫发作可激活自身免疫系统，导致炎症介质的释放增加。已有很多确切的证据提示，白细胞介素-1β、转化生长因子-β、前列腺素E2、环氧化酶-2 等炎性介质在痫性发作起始和进展过程中起了重要作用^[9]。那么作为促炎症因子的HMGB 1是否也参与了癫痫的发生发展？给予HMGB 1抑制剂是否可以减轻癫痫所致血脑屏障破坏等脑损伤？为此我们建立了氯化锂匹罗卡品大鼠癫痫持续状态(status epilepticus,SE)模型，通过Westren-blot测定了大鼠癫痫持续状态后HMGB 1的表达情况；并通过检测伊文思蓝渗出量，探索HMGB 1抑制剂甘草酸干预对SE后大鼠血脑屏障的影响。

12周龄的雄性SD大鼠，体重220～250 g，由四川省人民医院实验动物中心提供，并经过医院动物伦理委员会批准。

甘草酸(上海碧云天)、氯化锂(Sigma，USA)、匹罗卡品(Sigma，USA)、伊文思蓝(Sigma，USA)、PVDF膜(美国Millipore公司)、PMSF(上海碧云天)、BCA蛋白浓度试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)、5xSDS上样缓冲液(上海碧云天)、恒温水浴摇床(Bio-Rad，USA)、切片机(Leica，德国)、微量进样器(高鸽，上海)、荧光显微镜(Olympus，日本)。

大鼠在清醒状态下腹腔注射氯化锂127 mg/kg，18～22 h后腹腔注射硫酸阿托品1 mg/kg，30 min后，腹腔注射匹罗卡品30 mg/kg，给药后根据Racine分级观察大鼠行为学表现，持续性发作(反复的Racine分级Ⅳ级以上发作)，持续60 min以上视为癫痫持续状态造模成功，腹腔注射匹罗卡品半小时后，如未出现Ⅳ级及以上痫性发作的大鼠，每间隔10 min给予10 mg/kg匹罗卡品追加注射，直至大鼠出现Ⅳ级及以上的发作。造模成功后，立即给予地西泮10 mg/kg腹腔注射终止其发作，15 min后若还未能终止，可追加地西泮10 mg/kg。

①将成年雄性SD大鼠随机分为3 h对照组、癫痫3 h组、癫痫24 h组、癫痫72 h组，每组各8只，癫痫组经腹腔注射氯化锂-匹罗卡品构建癫痫持续状态模型，并分别在癫痫造模成功后3 h、24 h、72 h处死，3 h对照组与癫痫3 h组同时造模，在对应时间点给予等量生理盐水腹腔注射，并在匹罗卡品注药时间点后3 h处死，所有大鼠处死后提取海马组织，利用Westren-blot法检测HMGB 1蛋白表达情况。②将大鼠随机分为对照组、癫痫组、甘草酸干预组(GA 30 mg/kg)，每组各8只，癫痫组及甘草酸干预组均采用上述方法造模，此外，甘草酸干预组在癫痫造模成功后2 h给予30 mg/kg甘草酸腹腔注射(本实验的预实验结果表明，在癫痫造模成功后1 h、2 h、3 h各时间点测定HMGB 1表达量，1 h时表达并无增加，2 h时有轻度升高趋势，3 h时即显著增加，故我们选用了HMGB 1表达出现增高之初，即SE后2 h给予HMGB 1活性抑制剂干预)，其余两组则在对应时间点给予等量生理盐水，3组大鼠均在造模成功后24 h处死，取大脑测定伊文思蓝渗出量。③所有上述各组如果因模型不成功、死亡等因素，造成每个子组的样本量不足，需按照随机原则对应样本进行补充。

将大鼠海马组织分别研磨匀浆后，加入蛋白裂解液，4℃放置2 h，低温离心机10000转离心10 min，收集上清分装。按考马斯亮蓝试剂盒操作检测蛋白含量。制备100 g/L的分离胶、50 g/L的浓缩胶的聚丙烯酰胺凝胶，依次经上样，电泳，转印于NC膜上，封闭。用一抗稀释液分别稀释β-actin抗体(1∶5000)，HMGB 1抗体(1∶2000)，将PVDF膜放入一抗反应液中，4°C孵育过夜。将PVDF膜放入用5%脱脂牛奶封闭液配制的二抗反应液中(根据一抗选用相应的二抗及浓度)，室温震荡混匀1 h。TBST振荡洗漆3次×15 min。将显色剂按说明书比例配液，振荡器摇匀，显影，以β-actin作为内参照，.条带光密度分采用数字凝胶成像分析系统进行扫描，使用Imaging software 4.0系统分析条带光密度，将目的蛋白条带的光密度值与内参(β-actin)的光密度值做比较，计算各目的蛋白的相对含量。

给予各组大鼠一侧股静脉2%伊文思蓝4 ml/kg注射，1 h后行心脏灌注，取出大脑后称重，置于试管，按照1 ml/100 mg脑组织的比例加入甲酰胺溶液。轻微撵碎，安置于60℃水浴箱24 h，取出后离心(4000 r/min)，取上清液，再离心(12000 r/min)，再取上清液，每个标本取出200 μl上清液置于96孔板，同时制作标准孔，放置于全波长酶标仪，选取波长620 nm测OD值，根据测量结果，计算每个标本伊文思蓝浓度，通过伊文思蓝渗出量来作为血脑屏障通透性的评价指标。

数据用SPSS 19.0软件进行分析，计量资料采用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

Western-blot检测结果表明，大鼠海马组织HMGB 1蛋白在癫痫3h组较3h对照组表达增加(P＜0.05)；在癫痫24 h组较癫痫3 h组表达升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；在72h癫痫组较24h对照组表达有所下降(P＜0.05)。见图 1。

图 1 各组大鼠海马组织HMGB 1蛋白的表达情况。A：HMGB 1蛋白及β-actin的典型Western-Blot条带。B：HMGB 1/β-actin的相对光密度值值。SHAM(3 h)=3 h对照组，SE(3 h)=癫痫3 h组，SE(24 h)=癫痫24 h组，SE(72 h)=癫痫72 h组。*表示两组差异有统计学意义，P＜0.05。

图选项

将伊文思蓝渗出量作为血脑屏障通透性的评价指标。在酶标仪测量后，经过数据转换和统计，单位取μg/100mg脑组织，癫痫发作后24h各组大鼠大脑伊文思蓝浓度测定分别为：对照组5.5±1.1、癫痫组10.9±1.3、甘草酸干预组9.4±1.8。癫痫组较对照组渗出增加(P＜0.05)；甘草酸干预组后相较癫痫组渗出明显减少(P＜0.05)。见图 2。

图 2 各组大鼠大脑伊文思蓝渗出情况。A：三组之间伊文思蓝染色后连续脑组织切片典型图像，癫痫模型组与对照组相比明显蓝染，黄芩苷干预后脑组织蓝色渗出减少。 B：三组伊文思蓝渗出情况柱状图。SHAM=对照组，SE=癫痫组，SE+GA=甘草酸干预组。*表示与对照组相比，P＜0.05；&表示与癫痫组相比，P＜0.05。

图选项

HMGB 1蛋白是一种促炎症细胞因子，其几乎存在于所有有核细胞核内，发挥稳定核小体结构、调节基因转录等功能。在机体受到刺激时HMGB 1可通过主动或被动形式释放到细胞外，发挥促炎因子的作用，引发组织损伤及炎症反应。现有研究表明HMGB 1参与了许多组织脏器的炎症反应，在脑缺血、脑外伤、脑炎及脑发育畸形等神经系统疾病中，均可观察到脑实质内、脑脊液及血液中HMGB 1升高^{[4, 5, 6]}。本研究发现氯化锂匹罗卡品诱导大鼠癫痫持续状态后，大鼠海马组织中同样也出现了HMGB 1的合成和表达增加，该结果提示HMGB 1可能参与了癫痫持续状态后的病理生理过程。

癫痫具有复杂的病理生理机制。目前，越来越多基础及临床研究表明，癫痫可导致血脑屏障的损害。大量的动物及临床试验均证实，癫痫发作后可检测到相应血脑屏障渗透性标记物渗出增加^{[20, 21]}。而血脑屏障完整性的破坏后，可继而出现白蛋白渗出、脑水肿、胶质细胞增生、神经元变性等脑损伤导致了癫痫的病情进展、恶化^{[10, 11]}。影响血脑屏障的机制众多，既往的研究表明，对影响血脑屏障通透性的主要机制可能是通过影响白蛋白、水通道蛋白AQp 4，整流钾通道Kir 4.1，内皮素I 等实现^{[12, 13]}。但随着研究的深入，越来越多的学者认为，IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-a等炎性因子表达增加可能是主要导致血脑屏障破坏的重要因素，因此，减少癫痫发作后炎症介质的表达，对维持血脑屏障的完整性至关重要^{[13, 14, 15]}。HMGB 1为促炎症因子，有研究表明抑制HMGB 1活性可以减轻HMGB 1释放引起的级联炎症反应及血脑屏障破坏、脑组织损伤等。Liu等^[18]报道静脉注射HMGB 1中和抗体可以显著减少大脑中动脉闭塞引起的脑梗死面积，改善运动功能，并且可以减轻血脑屏障破坏、抑制胶质细胞活化及炎症介质TNF-α、iNOS的合成。Okuma等^[19]对外伤性脑损伤大鼠的研究也得出类似结果。

既往研究证实，甘草酸可作为HMGB 1的高选择性抑制剂^{[3, 6, 7]}，本实验在大鼠痫持续状态后给予了HMGB 1抑制剂甘草酸拮抗HMGB 1的活性，减少了大鼠SE后血脑屏障的完整性的破坏。其原因可能是因为抑制了HMGB 1活性后，减少了下游一系列炎症因子的表达，从而减轻癫痫持续状态后血脑屏障破坏。

本研究初步探讨了癫痫持续状态与HMGB 1蛋白的因果关系，证实了癫痫持续状态可引起大鼠血脑屏障损害，HMGB 1活性抑制剂甘草酸可减轻了大癫痫持续状态后血脑屏障破坏，从而可能减少因血脑屏障受损继发的脑组织损害。本研究表明HMGB 1可能参与了防治癫痫后脑损伤的发生、发展，为癫痫防治提供了新的实验基础。