帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种中老年人常见的中枢神经系统退行性疾病，其主要病理变化是中脑黑质、纹状体多巴胺能神经元变性坏死及路易小体的形成，主要临床表现为静止性震颤、运动迟缓、肌强直、姿势步态异常及睡眠、情绪障碍等非运动症状。PD的发生、发展可能与遗传因素、氧化应激、线粒体功能障碍、免疫功能异常等多种因素有关，LRRK2、ATP13A2^[1]等基因突变与帕金森病的发病密切相关。目前PD的治疗主要有药物治疗、手术治疗和康复、心理治疗等。但无论何种治疗均不能阻止疾病的进展，更无法治愈。鉴于PD的病变部位局限，受累神经元相对单一，可以通过载体良好定位，因此被认为是最适合进行基因治疗的神经疾病之一。国内外就此进行了众多的实验，而且也取得了较好的结果，现就PD的基因治疗中常用目的基因的研究现状作一简要综述。 1 PD基因治疗研究的基础 1.1 PD基因治疗的动物模型

要研究PD基因治疗的效果，建立能模拟人类PD发病特征的动物模型至关重要。目前常用6-羟多巴胺(6-OHDA)立体定向微注入大鼠单侧黑质、内侧前脑束以及纹状体建立的偏侧PD大鼠旋转模型^[2]和向小鼠腹腔注射MPTP(MPP+)建立的双侧黑质损伤鼠模型进行基因治疗的研究，也有少部分向灵长类动物（如猴子）体内注射MPTP来建立与人类更为相近的模型^[3]，但由于其资金耗费及伦理问题应用较少。最近，转基因PD动物模型，如α-synuclein^[4]、LRRK2基因突变鼠和MitoPark^[5]在基因治疗研究中也得到了一定应用^[6]。 1.2 PD基因治疗的基因转移途径

基因转移的途径有两种，即直接法(in vivo)和间接法(ex vivo)。前者是指直接将携带有目的基因的载体注人到靶点，此途径简便、直接，但转染率低、靶向性差，可能会对宿主染色体表达产生一定的影响；而后者是指首先将目的基因转入到培养的靶细胞内，在体外筛选、扩增后移植入靶位点，这一途径转染率高，可以进行多基因联合转染，但其操作复杂，植入的靶细胞本身可能对周围的脑组织有侵袭危险。因此，在研究过程中应根据研究条件及目的选择合适的途径。 1.3 PD基因治疗的载体选择

1.3.1 病毒载体

病毒载体是目前基因治疗的主要载体，其主要包括腺相关病毒(adeno associated virus,AAV)载体、腺病毒(adenovirus,Ad)载体、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)载体以及逆转录病毒(retroviruses,RV)载体，目前国内外应用最多的是AAV载体。

AAV载体中的致病基因已去除，它可以高效转染非分裂细胞，但是可插入的DNA片段小，一般小于4.7 kb，且有产生插入性突变的危险。随着对这一载体的研究，其安全性也得到了认证，成为目前最常使用的基因转移载体^{[7, 8]}，最近McFarland等^[9]进行了重组腺相关病毒(rAAV)载体的研究，发现在小鼠纹状体系统中rAAV 2/1，2/5和2/8的转导率显著高于rAAV 2/2，为临床研究提供了更好的新型载体。

Ad载体可用于静息期细胞，也可用于分裂期细胞，转染率高，并且克服了AAV载体转染DNA片段小的缺点，在体外和体内均有较高的感染效率，但其具有一定的致病性，可引起宿主免疫反应。

HSV载体和RV载体也是PD基因治疗的主要载体。HSV载体为DNA病毒，具有嗜神经性和潜伏性，是神经系统疾病基因治疗的有效载体。RV载体（最常见的是HIV载体）为单链RNA病毒，转导的基因易于与宿主DNA整合，可以转染大于8 kb的基因片段，是转染大片段基因的良好载体。目前将慢病毒作为载体进行基因治疗方面的研究也较多，对其有效性有了初步的肯定^[3]。 1.3.2 非病毒载体

病毒载体不能通过血脑屏障，为平时的研究及临床应用带来不便。脂质体和受体介导的基因转移可以解决这一问题，但转导效率相对较低，同时需选择合适的载体。Swanson等^[10]将胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)与抗人类胰岛素受体的抗体结合成HIRmAb-GDNF，以通过血脑屏障来治疗帕金森猴，结果却没有发现神经保护效应，而引发了致胰瘤性及心肌炎等剂量相关不良反应，具体机制有待探讨，在临床研究中应慎用此类载体。 2 常用目的基因的选择 2.1 影响多巴胺代谢的相关基因

PD患者纹状体内多巴胺(dopiamine,DA)含量的显著降低是其临床症状出现的主要原因。DA是由酪氨酸经酪氨酸羟化酶(tyrosine Hydroxylase,TH)生成左旋多巴，再经芳香族氨基酸脱羧酶(aromatic amino acid decarboxylase,AADC)催化而成。作为这一反应的限速酶，而四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin,BH4)是TH的辅酶，GTP环化水解酶1(GTP cyclization hydrolase 1,GCH-1)是BH4生物合成所必须的酶。由此可见TH、ADCC及GCH-1酶的活性可影响生物体内多巴胺的水平。因此将TH、AADC或GCH-1基因导入体内以增加多巴胺的含量是目前PD基因治疗的常用策略之一。 2.1.1 TH基因

TH是多巴胺合成的重要限速酶，众多的试验研究也证实了这一基因治疗的有效性。Shi等^[11]将TH基因修饰的骨髓基质干细胞注入PD大鼠纹状体内，实验组显现了行为学的明显改善，而且多巴胺的含量也有明显的增加。众多类似的研究也同样发现了TH基因在PD治疗中的有效作用^{[2, 12, 13]}。 2.1.2 ADCC基因

ADCC基因的有效表达可以增加内、外源性左旋多巴的利用，减少甚至停用PD患者药物的使用。Muramatsu等^[7]将ADCC基因导入6位PD患者体内进行了为期6个月的一期临床试验，发现患者在UPDRS评分、运动症状及PET表现方面均展现了明显的改善，为ADCC基因临床治疗的安全性和有效性提供了四级证据。Christine等^[8]也有类似的临床发现。 2.1.3 GCH-1基因

GCH-1基因也是多巴胺生成的重要基因之一，目前对于此基因的研究主要采用联合基因研究的策略。鲁玲玲等^[14]将携带有TH、AADC和GCH-1三种基因和只包含TH+AADC、TH+GCH-1双重基因的骨髓基质干细胞分别移植到PD模型大鼠纹状体内，发现三重基因治疗组较AAv-TH+AADC组的效果更好，提示了除TH和AADC基因外，GCH-1基因也是进行基因治疗PD的重要目的基因。 2.2 神经营养因子基因 2.2.1 GDNF基因

胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)能特异性保护多巴胺能神经元，成为PD治疗最受关注的神经保护剂。Biju等^[15]向MPTP诱导的PD小鼠体内转导GDNF基因，发现GDNF可明显减少MPTT导致的多巴胺神经元退变。很多类似的研究也有同样的发现^{[3, 11, 16]}，印证了GDNF基因在PD治疗中的有效作用。但Su等^[17]发现经黒质途径向帕金森猴体内注入AAV2-GDNF时会引起严重的体重下降。同样Simmons等^[10]通过HIRmAb（人胰岛素受体单克隆受体）介导GDNF进入PD猴体内进行研究时，也出现了严重的过敏反应，引发了对GDNF导入方式安全性的思考。 2.2.2 BDNF基因

脑源性神经生长因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)是神经生长因子家族中的一员，具有一定的神经保护作用，因而被选为治疗PD的目的基因之一。Somoza等^[18]运用人骨髓间充质干细胞经过黑质途径向PD模型鼠介导BDNF基因，可见TH阳性细胞的增加，阿扑吗啡所致的运动障碍也得到了明显的改善。 2.2.3 VEGF基因

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)同样具有营养神经的作用，对多巴胺神经元的损害及退变也具有一定的保护作用。Yue等^[19]给予6-OHDA诱导的PD鼠VEGF治疗后，可以缓解阿扑吗啡所致的不对称旋转运动，一定程度上表明了它的神经保护作用。Herrán等^[16]也同样发现了VEGF的治疗作用。 2.2.4 Nurrl基因

Nurrl可以提高多巴胺转运体(DAT)和TH基因的转录，对DA能神经元的发育及存活同样具有重要作用。Heng等^[20]发现Nurrl基因敲除小鼠体内TH阳性神经元明显下降，间接说明Nurrl对于多巴胺神经元的正常存活具有重要作用。黄仕雄等^[21] Nurrl转基因治疗PD模型鼠时发现其能有效地增加鼠脑内多巴胺的含量和纹状体区TH的表达，运动症状也有改善。 2.3 神经递质平衡调节相关基因

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是脑内重要抑制性神经递质，由谷氨酸在谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)催化下合成，GABA的作用原理是抑制PD丘脑底核引起的靶核病理性兴奋，以此消除PD症状。LeWitt等^[22]对66位PD患者进行了临床试验，经过6个月的观察，发现GAD治疗组患者UPDRS评分便得到了明显的改善，虽然发现了一些可能由手术引起的不良反应，但仍不能掩盖GAD对PD患者的治疗作用。 2.4 多基因联合治疗

PD的病因复杂，单基因的转染可能会受局部微环境变化的影响，而使其治疗作用下降，同时转染多种基因，会有更好的效果。鲁玲玲等^[14]将携带有TH、AADC和GCH-1三重基因及TH+AADC、TH+GCH-1双重基因的骨髓基质干细胞移植到PD模型大鼠纹状体内，观察各组PD模型鼠的行为改变及组织内多巴胺的含量，结果显示三重基因组较双重基因组效果更明显。而且TH+GCH-1及TH+GDNF双重基因比单基因治疗有更为明显的行为改善作用^{[11, 23]}。 3 问题与展望

传统的帕金森病药物治疗和手术治疗只能近期改善部分症状，并不能阻止病情的发展，基因治疗是一理想的治疗方式，但在目前仍不成熟，动物试验虽取得了较好的效果，但进行的临床试验较少，许多问题还有待解决，比如基因治疗的载体安全性及靶向性有待提高，基因治疗导入途径的安全性及有效性有待进一步明确，基因治疗对移植部位微环境的影响大小尚不确定，所致的不良反应还有待进一步解决，PD动物模型与人类本身的生物学差异及对基因治疗的效应差异仍需要进一步的探索及研究。鉴于目前的相关研究，我们认为在对相关基因有效性及安全性研究的基础上，PD基因治疗应向多基因联合转导的方向发展，同时着手开展更多的临床实验，为基因治疗进入临床应用做好准备。