国际神经病学神经外科学杂志  2014, Vol. 41 Issue (3): 221-226

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吕欣欣, 张瑞雪, 唐吉友
LV Xin-Xin, ZHANG Rui-Xue, TANG Ji-You
细胞外信号调节激酶1/2与Rho激酶作用对脑梗死后神经血管单元的影响
Regulatory effect of interaction between extracellular signal-regulated kinase 1/2 and Rho-associated kinase on neurovascular unit after cerebral infarction
国际神经病学神经外科学杂志, 2014, 41(3): 221-226
Disease Surveillance, 2014, 41(3): 221-226

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收稿日期：2014-03-04
修回日期：2014-05-27
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吕欣欣, 张瑞雪, 唐吉友. 细胞外信号调节激酶1/2与Rho激酶作用对脑梗死后神经血管单元的影响[J]. 国际神经病学神经外科学杂志, 2014, 41(3): 221-226.
LV Xin-Xin, ZHANG Rui-Xue, TANG Ji-You. Regulatory effect of interaction between extracellular signal-regulated kinase 1/2 and Rho-associated kinase on neurovascular unit after cerebral infarction[J]. Disease Surveillance, 2014, 41(3): 221-226.
细胞外信号调节激酶1/2与Rho激酶作用对脑梗死后神经血管单元的影响
吕欣欣1, 张瑞雪2, 唐吉友3    
1. 泰山医学院, 山东省泰安市 271000;
2. 山东大学, 山东省济南市 250000;
3. 山东大学附属千佛山医院神经内科, 山东省济南市 250000
收稿日期:2014-3-4; 修回日期: 2014-5-27
作者简介: 吕欣欣(1987-),女,在读研究生,主要从事脑血管病的基础与临床研究.
通讯作者：唐吉友(1963-),男,博士生导师,主任医生,主要从事脑血管病、癫痫、睡眠障碍的研究.Email:tangjiyou@sohu.com.
摘要：目的 研究脑梗死后细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)和Rho激酶(ROCK)两条信号通路通过相互作用激活下游效应分子多聚ADP核糖聚合酶-1(PARP-1)来调控脑梗死后神经血管单元.方法 该实验分为两个部分:35只SD大鼠随机分为假手术组(S)和脑梗死组(M),脑梗死组根据脑梗死后时间不同又分为1 h、3 h、12 h、24 h、3 d和7 d六个亚组,分别采用western blot检测假手术组及脑梗死组各亚组ERK1/2、ROCK蛋白表达水平.35只SD大鼠随机分为对照组、模型组、U0126组、Fasudil组和U0126+Fasudil组,分别检测神经功能、脑梗死面积以及ROCK、ERK1/2及PARP-1的蛋白表达水平.结果 假手术组各个时间点总ERK1/2和p-ERK1/2表达相同.脑梗死组总ERK1/2表达不变,p-ERK1/2表达先降低后升高,24 h时达最高峰.脑梗死组ROCK的表达随时间的延长逐渐升高,12 h表达达高峰,随后表达下降.模型组与对照组相比,p-ERK1/2、ROCK及PARP-1的表达显著提高(P<0.05);与模型组相比,Fasudil组p-ERK1/2的表达下降(P<0.05),而U0126组ROCK表达无变化(P>0.05),Fasudil组、U0126组及Fasudil组+U0126组PARP-1的表达显著下降(P<0.05),其中以U0126+Fasudil组下降最为显著.结论 ERK1/2和ROCK都参与了脑梗死后脑组织的损伤,ERK1/2可能作为ROCK的下游效应分子,与ROCK共同调节PARP-1的表达进而调控脑梗死后神经血管单元的存亡.
关键词： 脑梗死     神经保护     神经血管单元     细胞外信号调节激酶1/2     Rho激酶     多聚ADP核糖聚合酶-1     大鼠    
Regulatory effect of interaction between extracellular signal-regulated kinase 1/2 and Rho-associated kinase on neurovascular unit after cerebral infarction
LV Xin-Xin, ZHANG Rui-Xue, TANG Ji-You     
Taishan Medical College, Taian, Shandong 271000, China
Abstract:Objective To investigate the regulatory effect of interaction between extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) and Rho-associated kinase (ROCK) on the neurovascular unit by activating poly (ADP ribose) polymerase-1 (PARP-1) after cerebral infarction.Methods Thirty-five Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into sham-operation group and middle cerebral artery occlusion (MCAO) group. Each group was further divided into 1 hrs, 3 hrs, 12 hrs, 24 hrs, 3 days, and 7 days subgroups according to the time points when examination was performed after operation. The protein expression levels of ERK1/2 and ROCK were measured by Western blot. Another 35 SD rats were randomly divided into control group, model group, Fasudil group, U0126 group, and Fasudil+U0126 group, and neurological function, infarct area, and the protein expression levels of ERK1/2, ROCK, and PARP-1 were measured.Results For the sham-operation group, the expression of total ERK1/2 and phosphorylated ERK1/2 (p-ERK1/2) remained unchanged over time. For the MCAO group, the expression of total ERK1/2 remained unchanged, while the expression of p-ERK1/2 first decreased, then increased, and reached the peak level at 24 hrs after operation. The ROCK expression of MCAO group gradually increased over time, reached the peak level at 12 hrs, and then fell. Compared with the control group, the model group had significantly increased expression of p-ERK1/2, ROCK, and PARP-1 (P<0.05). Compared with the model group, the Fasudil group had significantly reduced expression of p-ERK1/2 (P<0.05), the U0126 group had unchanged expression of ROCK (P>0.05), and the Fasudil group, U0126 group, and Fasudil+U0126 group, especially Fasudil+U0126 group, had significantly reduced expression of PARP-1 (P<0.05).Conclusions Both ERK1/2 and ROCK are involved in the brain damage after cerebral infarction. ERK1/2, as a downstream effective molecule of ROCK, may regulate the expression of PARP-1 together with ROCK and thus adjust the survival of neurovascular unit after cerebral infarction.
Key words: cerebral infarction     neuroprotection     neurovascular unit     extracellular signal-regulated kinase 1/2     Rho-associated kinase     poly (ADP ribose) polymerase-1     rats    

脑梗死因具有极高的致死率和致残率已成为研究的焦点。目前，脑梗死的治疗的主要措施是静脉溶栓恢复缺血区的血流[1]，因溶栓存在严格的时间窗限制和溶栓后再出血的风险，所以临床应用中受到一定的限制，因此迫切需要寻求一种更有效的治疗脑梗死的方法。以细胞信号通路为基础的神经保护是一种治疗脑梗死的有效措施，Rho激酶(Rho-associated kinase,ROCK)和细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal regulated kinase1/2,ERK1/2)介导的信号通路通过参与调节脑梗死后神经细胞的生长，在脑梗死后神经保护中发挥重要的作用。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(poly ADP ribose polymerase-1,PARP-1)作为ERK1/2和ROCK共同的下游靶点蛋白，是神经血管单元各成分中细胞生长调控的关键效应蛋白。因此，探讨ERK1/2、ROCK对其下游靶点蛋白PARP-1的表达的调控及其具体机制，对临床脑梗死的神经保护治疗具有重要的指导意义。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物与分组

健康雄性SD大鼠(体重250～300 g)，由山东中医药动物实验中心提供。本实验分两个部分，一、SD雄性大鼠35只，体重250～300 g，随机分为假手术组(S)，脑梗死组(M)。各组根据不同的时间点分为1 h、3 h、12 h、24 h、3 d和7 d共6个亚组，每组5只。二、SPF级雄性SD大鼠35只，随机分为对照组(S)，模型组(M)，U0126组(U)，Fasudil组(F)，U0126+Fasudil(U+F)组，每组8只大鼠。 1.1.2 主要试剂

兔抗大鼠多克隆磷酸化ERK1/2抗体、兔抗大鼠多克隆总ERK1/2抗体(cell signaling,USA)，山羊抗大鼠多克隆ROCK抗体(Santa cruz,USA)，兔抗大鼠多克隆PARP-1抗体(abcam,Britain)，ERK1/2受体阻断剂U0126(selleck,USA)，ROCK阻断剂Fasudil(法舒地尔，碧云天生物有限公司)，TTC染色剂(sigma,USA)。 1.2 方法 1.2.1 大脑中动脉模型的制作

雄性SD大鼠，体重约280～300 g，10%水合氯醛0.3 ml/kg腹腔注射麻醉。根据Zea-longa改良线栓法[2]制作右侧大脑中动脉缺血模型：依此分离颈总、颈内及颈外动脉，结扎颈外动脉及颈总动脉近心端，动脉夹夹闭颈内动脉远端，一根头端沾有硅胶的鱼线从颈总动脉近分叉处缓慢插入颈内动脉，直到略感阻力，即大脑中动脉和大脑前动脉分叉处，进线18±0.5 mm。整个实验保持大鼠体温37±0.5℃。对照组进行相同手术，但不插线，其余步骤同制作大脑中动脉模型。 1.2.2 干预措施

对照组、模型组、U0126组、Fasudil组、U0126+Fasudil组分别在模型制作前30 min及造模后12 h给予大鼠尾静脉注射DMSO、DMSO、ERK1/2抑制剂U0126(30 mg/kg[3])、ROCK抑制剂Fasudil(10 mg/Kg[4])、联合应用抑制剂U0126+Fasudil。 1.2.3 神经功能评分

术后24 h进行大鼠神经功能评分，依据评分标准[2]：0分：无神经功能缺损；1分：提尾时，大鼠脑梗死对侧(左侧)前爪不能伸展；2分：对侧前爪(左侧)抓地力下降；3分：大鼠自发向跟各方向转圈，提尾时向对侧(左侧)转圈；4分：大鼠自发向对侧(左侧)转圈；5分：大鼠昏迷或死亡。 1.2.4 TTC染色

大鼠行神经功能评分后，在10%的水合氯醛麻醉下断头取脑,-20℃冰箱冷冻10 min后连续冠状切片(厚2.0 mm，6片)，TTC(2%，由1%PBS配制)37℃恒温箱中避光染色30 min后置于多聚甲醛溶液中固定24 h，切片在蓝色背景下进行正反两面拍照，image-plus图像处理软件计算脑梗死面积。 1.2.5 western blot检测

评分后断头取脑，分离右侧大脑皮质，取100 mg大脑皮质溶解于1 ml RIPA(细胞裂解液)+10 μl PMSF(蛋白酶抑制剂)(碧云天生物有限公司，中国)混合溶液中，然后碾磨、离心、取上清、测蛋白浓度(蛋白浓度测定盒(BCA)，碧云天生物有限公司，中国)。蛋白浑浊液和上样缓冲液按5∶[DK)]1混合后95℃变性5 min，取50 μg蛋白样品上样，凝胶电泳、280 mA恒流下转移到PVDF膜上、在5%脱脂奶粉中封闭1 h，然后加一抗［抗磷酸化ERK1/2(1∶[DK)]1000)、总ERK1/2(1∶[DK)]1000)、ROCK(1∶[DK)]200)、PARP-1(1∶[DK)]200)、GAPDH(1∶[DK)]1000)抗体］孵育4℃过夜，二抗(1∶[DK)]5000)常温孵育1 h，ECL(Millipore，USA)发光试剂盒检测蛋白浓度，Image J图像处理软件分析灰度值。 1.3 统计学分析

计量资料用平均数±标准差(x[TX-*5]±s)表示，采用SPSS 17.0统计软件进行分析，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较应用LSD-Post Hoc检验。P<0.05表示差异有统计学意义。 2 结果 2.1 脑梗死后各时间点ERK1/2和ROCK在缺血侧大脑皮质的表达变化

脑梗死后各时间点的总ERK1/2表达不变，而磷酸化的ERK1/2(p-ERK1/2)随时间的延长表达逐渐升高，24 h时达最高峰(P<0.01)，随后ERK1/2的磷酸化水平逐渐降低。与假手术组相应时间点比较(由于假手术组各亚组蛋白表达相同，下面图 1中用S组表示假手术组各个时间点蛋白水平)，脑梗死组1 h、3 h p-ERK1/2的活性显著降低(P<0.05)，12 h、24 h ERK1/2的磷酸化水平明显高于假手术组(P<0.05)，24 h磷酸化水平脑梗死后3 d和7 d p-ERK1/2蛋白的水平仍高于假手术组(P<0.05)。见图 1、图 2。

图 1 脑梗死后不同时间点ERK1/2和ROCK的表达变化。
图选项

图 2 脑梗死后不同时间点ERK1/2和ROCK的表达变化。*和**为与对照组相比，p-ERK1/2的表达先降低后升高再降低(P<0.05；P<0.01)，ROCK的表达先升高后降低(#P<0.05；##P<0.01)。
图选项

脑梗死后不同时间点ERK1/2和ROCK的表达变化。*和**为与对照组相比，p-ERK1/2的表达先降低后升高再降低(P<0.05；P<0.01)，ROCK的表达先升高后降低(#P<0.05；##P<0.01)。 2.2 脑梗死后24 h不同组间神经功能评分

脑梗死后24 h神经功能评分，与对照组相比，模型组、U0126组、Fasudil组及U0126+Fasudil神经功能评分增加，有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，U0126组及Fasudil组神经功能评分降低(P<0.05；P<0.05)，U0126+Fasudil组神经功能评分明显降低(P<0.01)。与U0126组或Fasudil组相比，U0126+Fasudil组神经功能评分降低具有统计学意义(P<0.05)。见表 1。

表 1 各组大鼠神经功能缺损评分
SMFUU+F
神经功能评分02.6±0.5#1.9±0.6#*2.1±0.6#*1.4±0.5#**+&
注：#为与对照组相比，P<0.05；*为与模型组相比，P<0.05；**为与模型组相比，P<0.01；+为与F相比，P<0.05；&为与U组相比，P<0.05。
表选项
2.3 脑梗死面积

脑梗死面积的测定结果显示，对照组染色未见脑梗死；模型组脑梗死面积占整个脑组织面积比例为26.6±1.5；与模型组相比，U0126组、Fasudil组脑梗死面积较模型组明显减小(P<0.05)，分别为23.1±1.3和22.6±1.7；U0126+Fasudil组脑梗死面积为为14.6±0.9，显著低于模型组(P<0.05)、U0126组(P<0.05)及Fasudil组(P<0.05)。见图 3、图 4。

图 3 TTC染色示，红色为正常组织，白色为梗死部分。
图选项

图 4 各组脑梗死面积百分比比较。*和**为与MCAO组相比，P<0.05，P<0.01；+为与Fasudil组相比，P<0.05；&为与U0126组相比，P<0.05。
图选项
2.4 U0126、Fasudil对脑梗死后p-ERK1/2表达的影响

脑梗后24 h模型组p-ERK1/2表达与对照组相比明显增加(P<0.01)；Fasudil组p-ERK1/2的表达较模型组下降，仍高于对照组(P<0.05)；U0126组p-ERK1/2的表达较模型组显著下降(P<0.05)，与对照组相当(P>0.05)；U0126+Fasudil组与对照组相比，p-ERK1/2的表达显著减低(P<0.05)。见图 5、图 6。

图 5 U0126及Fasudil对脑梗死后p-ERK1/2表达的影响。
图选项

图 6 与S组相比，#P<0.05，##P<0.01；与MCAO组相比，**P<0.01，*P<0.05。
图选项
2.5 U0126及Fasudil对脑梗死后ROCK表达的影响

与对照组相比，模型组ROCK的表达上升(P<0.05)；应用Fasudil后，ROCK的表达显著降低，低于对照组(P<0.05)；U0126组ROCK的表达与模型组相比差异无统计学意义(P>0.05)；Fasudil+U0126组ROCK的表达与模型组相比明显降低(P<0.05)，与Fasudil组相比差异无统计学意义(P>0.05)。见图 7、图 8。

图 7 U0126及Fasudil对脑梗死后ROCK表达的影响。
图选项

图 8 U0126及Fasudil对脑梗死后ROCK表达的影响。#和##为与S组相比，P<0.05，P<0.01；**和*为与MCAO组相比，P<0.01，P<0.05。
图选项
2.6 U0126及Fasudil对脑梗死后PARP-1表达的影响

脑梗后24 h模型组PARP-1的表达量增多，与对照组相比显著提高(P<0.05)；Fasudil组及U0126组与模型组相比，PARP-1的表达均降低(P<0.05，P<0.05)；Fasudil+U0126组PARP-1的表达量最低，与单独应用Fasudil或U0126组相比有显著差异(P<0.05)。见图 9、图 10。

图 9 U0126及Fasudil对脑梗死后PARP-1表达的影响。
图选项

图 10 U0126及Fasudil对脑梗死后PARP-1表达的影响。#和##为与S组相比，P<0.05，P<0.01；**和*为与MCAO组相比，P<0.01，P<0.05；++为与Fasudil组相比，P<0.01；&为与U0126组相比，P<0.05。
图选项
3 讨论

ERK1/2是细胞内重要的信号调节激酶，参与细胞的生长、增殖及分化过程，并且在中枢神经系统中广泛表达，调节神经细胞对外界刺激信号的反应。ERK1/2激活具有双重作用，既能够调节细胞生长，也可以诱导细胞死亡[5]。一方面ERK1/2通过介导基质金属蛋白酶(MMP-9)和组织蛋白酶组织抑制因子(TIMP-1)及炎症因子的表达，加重脑缺血损伤[3, 6, 7]。另有研究表明槐定碱(sophoridine)及Dex能够上调ERK1/2的表达进而减轻脑水肿、神经坏死以及减少梗死体积[8, 9]。我们的研究采用永久性大脑中动脉缺血模型，结果显示，p-ERK1/2的表达在脑梗死早期下降，脑梗死后24 h明显增加，U0126能够阻断p-ERK1/2的激活，降低脑梗死面积，改善神经功能。由此我们推断在脑梗死早期ERK1/2的表达上调，有助于保护脑缺血急性期神经功能损伤，在脑梗死后期，p-ERK1/2的过表达反而加重神经功能损伤，因此阻断此通路对脑梗死有保护意义。

Rho/ROCK信号通路通过调节细胞肌动蛋白微丝骨架的聚合状态，调控细胞黏附、迁移、增殖与凋亡。前期实验发现缺血后6 h ROCK底物P-内收蛋白(P-adducin)在缺血区表达明显增加[10]。RhoA蛋白破坏轴突生长锥，损伤神经的恢复[11]。ROCK通过降低一氧化氮合酶(eNOS)的表达影响血管舒张[12]、调节急性缺血后的炎症反应、破坏血脑屏障[13]参与脑梗死的发生和发展过程。我们的实验显示，脑梗死后ROCK的表达升高，在脑梗死后12 h ROCK的表达达高峰，持续一段时间后下降，可能因为我们的实验采用的是永久性脑梗死模型，所以ROCK表达变化在时间上存在一定的差异，本实验应用ROCK阻断剂，显著降低神经功能损伤，与之前的研究相一致[4, 12, 14]。ROCK通过以上多条途径参与脑梗死后神经血管的损伤，因此，早期应用ROCK阻断剂对脑梗死的治疗有一定的临床意义。

ERK1/2和ROCK这两条信号通路同时参与地塞米松诱导去甲肾上腺素介导的血管平滑肌收缩、前列环素PGE2调节细胞表面趋化因子7抗体表达介导人类单核细胞的迁移[15, 16]。血管紧张素Ⅱ诱导肠系膜上动脉的收缩和血小板生长因子(PDGF)介导恶性胶质瘤的增殖的过程都通过ERK1/2介导，这种作用均可以被ROCK阻断剂Y-27632阻断，推测ROCK可能是ERK1/2的上游分[17, 18]。我们的研究也证明了ERK1/2很可能作为ROCK的下游效应分子，参与到脑梗死后信号通路的调控。

脑缺血后，一系列NO自由基和超氧自由基引起DNA断裂，诱导PARP-1过度表达，通过消耗NAD+和促进线粒体释放细胞凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor,AIF)及调控的炎症基因表达促进细胞死亡。脑缺血后过度激活PARP-1介导的细胞毒性存在于神经血管单元的各成分中，虽然刺激PARP-1激活的因子种类、发生的时间及作用机制不同，但最终导致神经血管单元各组成部分的功能紊乱及细胞毒性将直接或间接影响神经元的功能[19]。抑制缺血半暗带区PARP-1的激活，可以显著减少脑梗死面积，改善神经功能[20]。本研究发现：ERK1/2阻断剂及ROCK阻断剂都能够降低PARP-1的表达，减少脑梗死面积，提高神经功能评分，说明ERK1/2和ROCK这两条信号通路都通过PARP-1发挥脑梗死后的调控作用。并且已有研究显示PARP-1上有ERK1/2直接磷酸化位点[21]，关于ROCK如何通过PARP-1发挥作用需进一步研究。

总之，脑缺血后，ERK1/2和ROCK通过介导炎症因子的激活、细胞因子诱导的细胞外基质蛋白酶表达等途径，导致包括神经元、血脑屏障、胶质细胞、细胞外基质等结构的神经血管单元损伤，同时ERK1/2作为ROCK的下游效应分子，与ROCK共同调节PARP-1的表达进而调控脑梗死后神经血管单元的存亡。

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