淡水水域的藻华问题一直是水环境领域的热点研究问题之一，近年来藻华的爆发频度和严重程度呈加剧趋势，如何从爆发机理上解释藻华问题成为藻华预警及控制技术的重点突破方向. 铁(Fe)作为藻类生长发育所必需的矿质营养元素之一，是藻类细胞色素（铁卟啉）的组成成份，而且又是电子传递反应中重要的氧化还原酶的基本元素，Fe的供应对于类囊体膜的结构和功能以及光化学能量转换过程都是重要的影响因素，在光合作用、呼吸作用、固氮作用、蛋白质与核酸合成等生理代谢过程的电子传递及酶促反应中发挥着极为重要的作用^[1-5]. 藻华研究中近年来还出现“铁限制”学说，已得到许多学者支持和成果验证^[6-7]. 胡权^[8]通过研究Fe(II)、Fe(III)对藻类生长的影响，发现在相同的水中游离态浓度下，Fe²⁺较之Fe³⁺，藻类表现出更快的促进时效及更大平均增长速率. Ahern等^[9]在澳大利亚Moreton湾北部进行原位试验，以确定氮、磷及有机螯合铁对水体环境中蓝细菌巨大鞘丝藻(Lyngbyamajuscula)生长的影响，结果显示3种营养盐均能够促进藻类生物量增加，其中有机螯合铁(Fe-EDTA)的作用效果最为明显，并且铁和磷有助于提高巨大鞘丝藻的固氮作用. 可以看出铁在藻类生长的过程中起着非常重要的作用.

目前，关于铁对藻类影响的研究主要集中在游离态的Fe(II)、Fe(III). 而铁在水体中主要以溶解态铁、胶体态铁和颗粒态铁3种形式存在. 溶解态铁主要以Fe(II)、Fe(III)以及其他化学形式存在，Fe(III)的溶解度极低，但其在好氧环境中含量丰富，且有机螯合态铁配体占总溶解态铁的90%以上^[10]. Hopkin- son和Morel^[11]认为，水体中溶解性铁主要以有机配体形式存在，且大多数光合微生物（藻类）均具备摄取强铁螯合物及铁载体的能力.

本文以四尾栅藻(Scenedesmus quadricanda)、水华鱼腥藻(Anabaena aquae)为绿藻、蓝藻的代表藻种，选取EDTA铁、腐殖酸铁、草酸铁、柠檬酸铁铵4种不同络合态铁，对比研究铁的不同络合态和铁质量浓度变化对藻类增殖过程的影响，为构建藻华预警模型、控制藻类生长预防藻华及水体的富营养化修复提供依据.

1 材料与方法 1.1 实验仪器

SPX-250生化培养箱，上海悦丰仪器仪表有限公司；BK5000生物显微镜，重庆奥特光学仪器有限责任公司；SC3610低速离心机，安徽中佳科学仪器有限公司；T6新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司.

1.2 藻种及培养方法

试验用四尾栅藻和水华鱼腥藻购自中国科学院武汉水生生物研究所，培养基为BG-11.

四尾栅藻和水华鱼腥藻试验前均进行扩大培养，在对数增长期时离心收集藻细胞(5 000 r/min，15 min)，用缺铁BG-11培养基饥饿培养3 d，去除原培养基中残留铁的影响. 取饥饿培养后藻液接种到改良培养基中，培养基控制初始总氮、总磷分别为10.0 mg/L和1.0 mg/L，以柠檬酸铁铵、草酸铁、EDTA-Fe、腐殖酸铁为外加铁源，同批次培养初始铁质量浓度分别为0.3 mg/L、0.6 mg/L、0.9 mg/L、1.2 mg/L、1.5 mg/L，所有营养物质一次加入，试验周期内不再补充. 考虑到不同藻种之间生物个体体型的差异及藻种爆发生长所需的初始藻种基数，四尾栅藻和水华鱼腥藻控制接种细胞密度分别约为5×10⁶ 个/L、2×10⁷ 个/L，光照强度为2 000 lx，温度为25 ℃，光暗时间比为12∶12，每天定时摇晃锥形瓶2 ~3次，减少器壁效应，并变换培养瓶位置，以减少光照不均的影响.

1.3 测试方法

取一定量四尾栅藻（水华鱼腥藻）藻液，按不同倍数稀释后，分别测定其在650(680) nm处的吸光度值A₆₅₀(A₆₈₀). 另从稀释后的藻液中取0.5 mL滴入载玻片上，染色固定后，在显微镜下计数，同步做3个平行样. 生物量用3个平行样的平均值表示，绘制四尾栅藻生物量N₁（水华鱼腥藻N₂）与吸光度A₆₅₀(A₆₈₀)的标准曲线如式(1)、(2)所示. 试验期间，每天9:00定时用分光光度法检测藻生物量，再根据生物量与吸光度关系换算出生物量.

$\left\{\begin{array}{l}{N_1} = 555\;555.56{A_{650}} + 1\;111,\\[5pt]{R_1}^2 = 0.999\;4.\end{array}\right.$

(1)

式(1)中，N₁为四尾栅藻生物量，个/L；A₆₅₀为650 nm处四尾栅藻的吸光度值，Abs.

$\left\{\begin{array}{l}{N_2} = 596\;609.65{A_{680}} - 3\;482.2,\\[5pt]{R_1}^2 = 0.999\;8.\end{array}\right.$

(2)

式(2)中，N₂为水华鱼腥藻生物量，个/L；A₆₈₀为680 nm处水华鱼腥藻的吸光度值，Abs.

1.4 图表设计及数据分析方法 1.4.1 雷达图和3D彩色映射表面图

“雷达图”，最早用于金融领域分析，现已广泛用于各领域的目标分析. 它通过列出研究目标在各个方向的水平，从而清晰地反映出目标各项指标的变动情形及其好坏趋向. 本研究中，将4种络合铁在各质量浓度的藻峰值应用雷达图进行分析，可以看出某种铁源实验组在各铁质量浓度下的生长情况，比较出较佳铁质量浓度；通过不同铁形态环线之间的对比，又可得出各铁质量浓度下适宜藻生长的铁形态分布.

“3D彩色映射表面图”能反映出目标在两个因素作用下的变化趋势情况. 将四尾栅藻、水华鱼腥藻的生长情况用3D彩色映射表面图可以明显地反映出藻峰值在铁形态和铁质量浓度作用下的峰值及变化的连续性，体现出四尾栅藻、水华鱼腥藻对于铁质量浓度和形态选择的趋向性.

1.4.2 双因素无重复试验方差分析

在试验中，用藻峰值作为藻生长情况的试验指标，铁形态和铁质量浓度作为影响试验指标的两个因素，选取4种铁形态水平、5个铁质量浓度水平进行试验，从而可以对试验结果进行双因素无重复试验方差分析. 通过对试验结果影响显著性的分析，可以从统计学的角度对铁质量浓度和铁形态对四尾栅藻和水华鱼腥藻的影响强弱进行对比.

2 结果与讨论 2.1 铁对四尾栅藻的影响

表1中列出了四尾栅藻在不同铁形态和浓度下20 d的藻峰值. 从表1中可以看出，四尾栅藻20 d的藻生物量随铁质量浓度的升高呈先升后降的趋势，在4种络合铁的5种铁质量浓度实验组中，生长情况最佳的铁质量浓度均为0.9 mg/L，其中柠檬酸铁铵试验组20 d的藻峰值可达到3.7×10⁷ 个/L. 在低质量浓度0.3 mg/L和高质量浓度1.5 mg/L中，生长情况最好的为腐殖酸铁实验组，适中铁质量浓度0.6 mg/L、0.9 mg/L、1.2 mg/L中生长情况最佳的为柠檬酸铁铵.

针对不同铁形态和铁质量浓度对四尾栅藻藻峰值的影响做雷达图分析（见图1）. 从图1中可以看出，不同的铁形态组间的藻峰值相差较大，不同铁质量浓度之间的藻峰值差距更显著. 因此，对表1中不同铁形态和铁质量浓度两因素对藻峰值的影响做无重复双因素方差分析，结果如表2.

由表2可知，铁形态的0.01<P-value $\leqslant$ 0.05，说明铁形态对藻峰值的影响显著（*）. 而铁质量浓度的P-value $\leqslant$ 0.01，说明铁质量浓度对藻峰值的影响非常显著（**），且影响的主次因素为：铁质量浓度>铁形态.

2.2 铁对水华鱼腥藻的影响

表3中列出了水华鱼腥藻在不同铁形态和质量浓度下20 d的藻峰值. 从表3中可以看出，水华鱼腥藻20 d的藻生物量随铁质量浓度的升高呈先升后降的趋势，在4种络合铁的5种铁质量浓度实验组中，生长情况较佳的铁质量浓度为0.6 mg/L和0.9 mg/L. 其中，生长情况最佳的柠檬酸铁铵实验组0.9 mg/L，20 d的藻生物量可达到2.46×10⁸ 个/L. 对各浓度的不同铁质量形态实验组藻峰值进行对比可发现，仅在1.5 mg/L质量浓度下不同铁形态实验组藻峰值有差别，其他浓度差别不大.

不同的铁质量浓度实验组间的藻峰值相差较大，不同铁形态实验组之间的藻峰值差距不明显（见图2）. 因此，对表3中不同铁形态和铁质量浓度两因素对藻峰值的影响做无重复双因素方差分析，结果如表4.

由表4可知，铁的形态F<F-crit，说明铁形态对藻峰值没有影响显著. 而铁质量浓度的F>F-crit，P-value $\leqslant$ 0.01，说明铁质量浓度对藻峰值的影响非常显著（**），而且对于水华鱼腥藻的影响，铁质量浓度要远远强于铁形态.

2.3 四尾栅藻和水华鱼腥藻的对比分析

从上述结果中可以看出，铁质量浓度和铁形态对于四尾栅藻和水华鱼腥藻的影响有所不同. 铁质量浓度对四尾栅藻和水华鱼腥藻均有非常显著的影响，两者的方差分析也表明，铁质量浓度对于水华鱼腥藻生长的影响要较四尾栅藻明显. 而铁形态对于四尾栅藻和水华鱼腥藻的作用却有明显的差别，铁形态对于四尾栅藻有显著影响，对于水华鱼腥藻没有显著影响. 从两种藻整体来说，铁质量浓度的影响要强于铁形态.

进一步将表1和表3中数据用三维轮廓图(3D color map surface)进行分析，见图3和图4. 如图3所示，铁质量浓度较低时，随着铁质量浓度的升高，藻峰值会增大，此时，铁质量浓度对四尾栅藻生长起促进作用. 当达到最佳铁质量浓度0.9 mg/L后，随着铁质量浓度的增加，藻峰值会减小，此时，铁浓度对四尾栅藻的生长起抑制作用. 如图4所示，与四尾栅藻相似，水华鱼腥藻藻峰值也随着铁质量浓度的增加先升后降. 但相对来说，水华鱼腥藻不同铁形态实验组之间藻峰值差异并不明显. 在各质量浓度实验组中，0.3 mg/L、0.6 mg/L、0.9 mg/L实验组的藻峰值都较高，在图4中呈现持平的趋势，这表明水华鱼腥藻在对于铁的形态和质量浓度的适应性较强，但过高的铁质量浓度会抑制水华鱼腥藻的生长. 胡权^[12]等通过调研广州大学城各水域中的营养状况发现，自然界中铁有Fe³⁺和Fe²⁺两种存在形式，调研水体中以Fe²⁺存在的铁占总铁的60%以上，易爆发藻华的水域铁质量浓度范围为0.145 mg/L至1.364 mg/L，进行纯培养的四尾栅藻和水华鱼腥藻最佳Fe²⁺质量浓度为0.4 mg/L. 说明适宜四尾栅藻和水华鱼腥藻生长最佳络合铁质量浓度要较铁离子浓度高，但适宜生长的铁质量浓度区间相差不大.

对两种藻的三维轮廓图沿浓度切线方向分析发现，对于四尾栅藻，柠檬酸铁铵对四尾栅藻生长的促进作用最强，腐殖酸铁和草酸铁次之，EDTA铁最弱. 而对于水华鱼腥藻而言，4种络合铁对水华鱼腥藻生长的促进作用相近，但随着铁质量浓度的升高，高质量浓度的铁对水华鱼腥藻生长的抑制作用要较四尾栅藻更强.

一般认为，藻对铁的吸收总体分为2个阶段：第1阶段与代谢无关，铁可能通过配位、络合、离子交换、物理吸附及微沉淀等作用中的一种或几种附着在细胞表面. 在这一过程中，金属和生物基质的作用较快，典型的吸附过程数分钟或数小时即完成. 第2阶段为生物富集过程，即与细胞代谢直接相关的过程，在此阶段中铁被运送至细胞内，并储存起来. Chen和Wang^[13]比较了海洋硅藻和蓝绿藻Synecho- cocussp.对与不同配合物结合的铁（铁载体、腐植酸、天然高相对分子质量化合物）的吸收，发现铁与腐植酸(HA)结合后仍可以以很高的速率被浮游植物所利用，而与铁载体结合的铁的吸收速率较低，并且浮游植物对铁的吸收与有机物–铁的结合能力呈负相关，即有机物与铁的结合能力越强，浮游植物对铁的吸收能力越弱，说明与有机物结合的铁必须首先进行生物转化然后进入细胞. 四尾栅藻和水华鱼腥藻分别属于绿藻和蓝藻，细胞壁组成结构等的不同导致它们对于EDTA铁、腐殖酸铁、草酸铁、柠檬酸铁铵吸收的响应情况会有所不同.

铁是藻类生长和增殖所必需的微量营养元素. 郭延^[14]通过设计TN、TP、Fe、Mn 4因素8质量浓度水平的均匀实验，发现4种营养元素对水华鱼腥藻影响的决策排序为Fe>TN>TP>Mn，微量元素Fe是水华鱼腥藻增殖的主要影响因素，而4种营养元素对四尾栅藻影响的决策排序为TN>TP>Fe>Mn，常量元素是四尾栅藻增殖的主要影响因素. 雷玉新等^[15]在针对微囊藻的研究中发现，在一定N、P比条件下，铁离子质量浓度为0 mg/L时，藻类基本不生长，表明铁元素为藻类生长所必需的元素；当铁离子质量浓度为1.2 mg/L时，藻类的叶绿素含量和最大增长速率最大，当铁离子质量浓度为4.8 mg/L时，藻类生长受到抑制. 由此可见，铁对于藻类的增殖起着极大的促进作用，在富含N、P等营养的条件下，铁甚至可以成为藻华爆发的主要影响因素. 而在自然水体中溶解性铁主要以有机配体形式存在的情况下，控制水体中络合铁含量对控制或减弱水华发生强度有着非常重要的意义.

3 结论

(1) 在4种铁形态和5种铁质量浓度中，四尾栅藻生长情况最佳的为0.9 mg/L的柠檬酸铁铵. 随着铁质量浓度的升高，铁对于四尾栅藻会有一个先促进后抑制的过程. 铁形态对四尾栅藻的生长影响显著（*），铁质量浓度对藻峰值的影响非常显著（**），且铁质量浓度的影响强于铁形态的影响.

(2) 4种铁形态和5种铁质量浓度中，水华鱼腥藻生长情况最佳的为0.9 mg/L的柠檬酸铁铵. 水华鱼腥藻对于铁的形态和浓度的适应性较强，但过高的铁质量浓度仍会对水华鱼腥藻的生长有抑制作用. 铁形态对水华鱼腥藻的生长没有显著性影响，铁质量浓度对藻峰值的影响非常显著（**）. 对于水华鱼腥藻的影响，铁质量浓度要远远强于铁形态.

(3) 综合四尾栅藻和水华鱼腥藻生长情况可知，不同藻种对于不同的铁源响应方式有所不同，铁质量浓度和铁形态对于藻类的影响程度在不同藻种之间也有不同. 一般而言，铁质量浓度对藻增殖的影响要强于铁形态.