低浓度微污染废水中持久性有机污染物的污染是当前水质污染的主要因素之一。氯苯是农药、炸药和染料的原材料之一，在生产、加工、使用中大量地进入环境中，广泛存在于水体、空气、土壤中，具有生物累积性、持久性，对环境有潜在危害性^[1]。氯苯对中枢神经系统有抑制和麻醉作用，对皮肤和粘膜有刺激性。重者引起中毒性肝炎，个别可产生肾脏损害^[2-4]。氯苯的广泛性使用及难以彻底消除，被美国环境保护局列入环境优先控制污染物之一^[5]。常用活性污泥法和生物膜法等技术处理含苯微污染废水，但这些方法中微生物在水中呈游离状态，生物处理后仍需经过沉淀、凝聚、过滤等后续处理。生物包埋法可以更好地固定微生物，减少高效工程菌的流失，也可以对生物膜形成更好的保护，减少有毒废水对微生物的毒性。研究表明使用固定化包埋颗粒可以实现污水处理厂二级出水深度脱氮，系统更易于启动，运行稳定，脱氮高效^[6]。Maryskova等^[7]发现利用固定化技术将云芝白腐菌中的漆酶与PA6混合包埋后，在三级处理中能有效去除含50 μM内分泌干扰物的污水。

目前最常用的包埋剂有聚乙烯醇(PVA)及海藻酸钠(SA)，但是，SA作为包埋剂具有不稳定、易破碎、易溶解等缺点，而PVA则存在硬度大、传质性能差等不足^[8-9]。使用PVA和SA混合制作载体，克服了材料各自的缺点，制成的载体材料形状规则，不易出现粘连现象，具有良好的机械强度和稳定性。但PVA-SA小球的吸附能力较弱，当作为包埋剂固定化目标菌株时，污染物不易与高效菌接触^[10]。活性炭属于无定型炭，由多层状结构的微晶不规则集合形成，具有很强的吸附能力^[11-13]。本实验利用海藻酸钠(SA)，聚乙烯醇(PVA)联合作为固定化微生物的包埋剂，分析PVA-SA固定化小球的最佳配比，然后在最佳配比条件下添加不同含量的活性炭，分析活性炭对PVA-SA小球包括稳定性、机械强度、传质性和降解苯系物效果的影响，旨在为固定化微球技术用于微污染废水的处理提供实验支持。

包埋剂：海藻酸钠(SA)，聚乙烯醇(PVA)；交联剂：CaCl₂，H₃BO₃。所用试剂均为分析纯。活性炭颗粒研磨，经过100目筛后用水煮沸，烘干备用。菌种：从含大量苯系物排放的厂区附近污泥中筛选出1株高效降解菌^[14]，经培养观察，鉴定为青霉菌。将该菌体于30℃，130 r·min^-1的摇床培养48 h后，10 000 r·min^-1离心10 min，用磷酸盐缓冲液洗涤菌体，沉淀并离心3次，浓缩收集菌体，用无菌水制备成菌悬液，在4℃下保存备用。

高速离心机，蠕动泵，磁力搅拌器，超净工作台，气相色谱仪(安捷伦GC-9890A).

经预实验，PVA质量分数确定为5%~7%，SA质量分数确定为1%~3%。（1）分别称取5 g、6 g、7 g PVA颗粒，加入250 mL烧杯中，然后加入100 mL蒸馏水，在磁力搅拌器中低速搅拌，然后调节温度至90℃，恒温搅拌1 h，即配成质量分数为5%、6%、7%的PVA溶液。（注意，在搅拌后期须严格控制温度和搅拌速度，防止PVA大量起泡）（2）分别称取1 g、2 g、3 g SA颗粒，加入250 mL烧杯中，然后加入100 mL蒸馏水，在磁力搅拌器中低速搅拌，然后调节温度至90℃，恒温搅拌1 h，即配成质量分数为1%、2%、3%的SA溶液。（3）分别称取2 g、3 g、4 g无水CaCl₂颗粒，加入250 mL烧杯中，然后加入100 mL蒸馏水，再加入约4 g H₃BO₃晶体，即可配制成质量分数为2%、3%、4%的CaCl₂饱和硼酸溶液。

以不同浓度PVA、SA、CaCl₂，选用L₉(3³)进行实验，正交实验如表1，等体积PVA与SA混合均匀，并在搅拌条件下不断滴入含不同浓度CaCl₂的饱和硼酸溶液中，充分交联制成复合凝胶小球，在温度为4℃的冰箱中静置24 h后取出，用生理盐水洗净凝胶小球后备用。凝胶小球的评分标准^[15-17]如表2所示。

表 1(Table 1)

表 1 正交实验表 Table 1 The orthorhombic experiment 水平 因素 A∶w(PVA) B∶w(SA) C∶w(CaCl2) 1 5 1 2 2 6 2 3 3 7 3 4

表 1 正交实验表 Table 1 The orthorhombic experiment

表 2(Table 2)

表 2 固定化小球评分标准 Table 2 Immobilized beads scoring criteria 项目 复合凝胶微球的形貌特征标准 评分（满分10分） 形状 绝大部分凝胶呈圆球形，几乎没有椭圆形及橄榄形 8~10 凝胶以圆球形为主，存在少量椭圆形及橄榄形 5~8 一半或一半以上的凝胶颗粒不呈圆球形 0~5 大小 全部凝胶微球直径=4 mm，大小均匀 8~10 绝大部分凝胶微球直径=4 mm，少部分直径=5 mm 5~8 绝大部分凝胶微球直径=4 mm，大小不均匀 0~5 成球性 成球性好，凝胶微球得率高 8~10 成球性较好，凝胶微球得率较高 5~8 成球性差，凝胶微球得率低 0~5 粘连性 凝胶微球间基本不存在粘连现象 8~10 小部分凝胶微球存在粘连现象 5~8 大部分凝胶微球存在粘连现象 0~5

表 2 固定化小球评分标准 Table 2 Immobilized beads scoring criteria

据正交试验结果，取PVA-SA最佳配比小球，与3 mL菌悬液混合均匀，加入0%、0.5%、1%、1.5%（质量分数，下同）活性炭粉末，将该混合液滴入含2% CaCl₂的饱和硼酸溶液中充分交联，制成PVA-SA小球，低温静置24 h后，生理盐水洗净备用。取50粒大小形状一致PVA-SA小球放置于等速摇床中搅拌震动48 h，观察小球的破损情况，并记录破损情况以判定小球的机械强度性能，每组重复3次。

将含不同质量分数活性炭的PVA-SA固定化小球各30粒分别置于装有不同浓度的HCl溶液和NaOH溶液中，保持溶液温度25℃不变，浸泡24 h后观察并记录各类型小球的溶解及形状变化。

在温度25℃下，分别取30粒粒径大小相同的含不同质量分数活性炭的PVA-SA小球置于装有15 mL蒸馏水的平板培养皿中，各滴加4滴蓝墨水，静置20 min后，沿中心切开小球，观察中心截面的颜色深浅及浸入半径，定性判断包埋固定化小球的传质性能。

取不同活性炭含量的PVA-SA小球分别加入100 mL无机盐营养液，使小球的体积填充率为20%（以小球的堆积体积计），同时加入2.7 μL氯苯和0.5 g吐温80使两者质量浓度和质量分数分别为30 mg·L^-1和 0.5%，调节pH值为6，在30℃，130 r·min^-1的恒温摇床培养，并设置菌液为对照组，分别于0、24、48、72、96、120、144 h测定锥形瓶中氯苯浓度，分析各组小球对氯苯的降解效率。

氯苯浓度使用气相色谱测定，气相色谱仪型号：GC-9890A；用二硫化碳1∶1萃取样品，加入适量无水硫酸钠后测氯苯浓度。检测器：FID；色谱柱：30 mm $ \times $ 0.53 mm $ \times $ 3.0 μm；检测器温度：230℃；柱温：80℃；载气：氮气；载气流速：20 mL/min；分流比：1∶1；进样量：2 μL；外标法计算水样中氯苯浓度。

按正交表1，对形成的9种复合凝胶微球进行打分。结果如表3所示。表3中K₁、K₂、K₃ 及k₁、k₂、k₃分别表示A、B、C因素各水平的实验结果总和及其均值；R值为极差，R值越大表明该因素对实验结果影响越大；T为各因素K值之和。

表 3(Table 3)

表 3 固定化小球正交试验结果和分析 Table 3 Immobilized beads orthogonal experiment results and analysis 试验号 因素 评分 总分 A B C 形状 大小 成球性 粘连性 1 5% 1% 2% 5 5 5 8 23 2 5% 2% 3% 6 5 8 9 28 3 5% 3% 4% 5 7 8 5 25 4 6% 1% 4% 8 7 8 8 31 5 6% 2% 2% 9 9 9 9 36 6 6% 3% 3% 8 7 8 5 28 7 7% 1% 3% 7 6 8 8 29 8 7% 2% 4% 6 7 8 9 30 9 7% 3% 2% 6 6 7 5 24 K1 76 83 83 T=K1+K2+K3=84.67 K2 95 94 85 K3 83 77 86 k1 25.33 27.67 27.67 k2 31.67 31.33 28.33 k3 27.67 25.67 28.67 R 6.34 5.66 1 优选方案 6% 2% 2%

表 3 固定化小球正交试验结果和分析 Table 3 Immobilized beads orthogonal experiment results and analysis

由表3对K值进行分析可知，K值越大，效果越好，所以固定化小球形成的最佳水平是A₂B₂C₃，即PVA、SA和CaCl₂的最优质量分数为6%、2%和4%。

综合极差分析得到3种因素对评分结果的影响为：PVA>SA>CaCl₂，可见CaCl₂对固定化小球的影响最小，且C因素各水平之间效果差别很小，对形成小球综合评分结果5号试验的分数最高，形成的固定化小球效果最好。因此从成本和小球质量综合考虑CaCl₂的浓度以2%为宜。并因此确定的PVA与SA及CaCl₂最优质量分数分别为6%、2%、2%。

对固定化小球机械强度进行测定，结果如图1所示。

图 1(Figure 1)

图 1 不同活性炭质量分数下PVA-SA固定化小球的破损率 Figure 1 The breakage rate of PVA-SA under the different activated carbon concentration

从图1可以看出，PVA-SA有良好的机械强度，震动48 h后小球的破损率只有10%左右。当加入活性炭后，形成的固定化小球破损率呈下降趋势，机械强度上升。当活性炭质量分数为1%时，震动48 h后破损率约为6%，随着质量分数继续增加到1.5%时，破损率反而有所上升，当加入的活性炭含量过高时会使PVA-SA小球机械强度下降。

不同活性炭含量的PVA-SA小球在酸碱溶液中的物理稳定性进行测定，结果如表4所示。

表 4(Table 4)

表 4 PVA-SA小球在酸碱环境中的稳定性 Table 4 The stability in acidic and alkaline environments of PVA-SA beads 活性炭质量分数/（%） c（HCl）/（mol·L-1） c（NaOH）/（mol·L-1） 空白 0.01 0.1 1 0.01 0.1 1 0 + ++ +++ +++ ++++ +++++ + 0.5 + + +++ ++ +++ +++++ + 1 + + ++ ++ ++ ++++ + 1.5 + + ++ + ++ +++ + 注：+略变软，略溶出；++变软，溶出；+++变软，溶出较多，结构松散； ++++变软溶出多，严重变形；+++++几乎完全溶解。

表 4 PVA-SA小球在酸碱环境中的稳定性 Table 4 The stability in acidic and alkaline environments of PVA-SA beads

由表4可见，PVA-SA小球在酸性溶液中的稳定性多数只呈现略变软，少量固状物溶出，而在碱性条件下，多数PVA-SA小球结构松散，变软，因此，PVA-SA小球在酸性条件比在碱性溶液中的稳定性好；随着活性炭含量的增加，固定化小球的稳定性增强。在试验中真菌在降解氯苯过程中中间产物主要是酸性物质，因此，该固定化小球有利于被应用在对有机污染物氯苯的降解处理中。

图2为不同活性炭质量分数下PVA-SA固定化小球的墨水浸入半径。从图2可见，沿着PVA-SA小球的中心截面切开，随着活性碳的含量增加，PVA-SA小球中墨水浸入的深度加大。含1.0%与1.5%活性炭的PVA-SA小球的整个截面几乎完全被染成了蓝色，0.5%活性炭的PVA-SA小球颜色沿球心方向呈渐减趋势，外面较深而中心颜色相对较淡，而未添加活性炭的PVA-SA小球的截面中心一部分几乎未被染色，由此可得出结论，活性炭的添加可以显著地提高固定化小球的传质性能，且在一定范围内，随着其含量的增加小球传质性能越好。

图 2(Figure 2)

图 2 不同活性炭浓度下PVA-SA固定化小球的墨水浸入半径 Figure 2 Under the different activated carbon concentration, the Ink immersion radius of PVA-SA

将含0%、0.5%、1%质量分数活性炭的小球加入到含30 mg·L^-1氯苯溶液中，测定不同时间固定化小球对氯苯的去除率（活性炭中去除浓度和初始浓度的比值），结果如图3所示。

图 3(Figure 3)

图 3 不同活性炭含量对氯苯去除效果的影响 Figure 3 The influence of different activated carbon content on the Chlorobenzene removal efficiency

从图3可见，未固定化的菌液对氯苯的降解在24 h内效率最低，随处理时间延长氯苯降解率逐渐上升，在144 h内降解率最终达到90%左右。表明该驯化的菌株是一株高效的氯苯降解菌。未加活性炭的PVA-SA小球和加0.5%活性炭的PVA-SA小球对氯苯的降解能力在144 h内只能达到70%~80%，这可能是因为包埋剂对菌株与溶液中的有机物接触有一定的空间阻碍作用，导致其降解性能降低；添加1.0%和1.5%活性炭的PVA-SA小球对氯苯的降解能力大大加强，在72 h时即可大于80%，在144 h时几乎与菌液的降解性能相当，可达90%。在固定化小球中添加活性炭粉末增强了PVA-SA小球的吸附性能，且增加了小球内部孔隙，可以将氯苯吸附到颗粒表面并传递到内部，加速了菌群对氯苯的降解。

综合活性炭对PVA-SA小球的传质性能、氯苯降解效果、机械性能及酸碱稳定性的影响，含1%活性炭的PVA-SA小球有很好的传质性能，对氯苯的降解性能好，且不易破碎，具有很好的机械强度及酸碱稳定性。

(1) 通过正交实验确定复合凝胶小球的最佳配比为w(PVA):w(SA):w(CaCl₂)=6%:2%:2%。

(2) 加入活性炭可以增强PVA-SA小球的机械强度、酸碱稳定性及传质性能。活性炭质量分数为1%时，PVA-SA小球的机械强度最高；活性炭质量分数为1.5%时，PVA-SA小球的酸碱稳定性及传质性能略高于含1%活性炭的PVA-SA小球。

(3) PVA-SA小球中活性炭含量超过1%时才能维持菌株的降解能力，在72 h内能达到80%以上的氯苯去除率。

(4) 综合活性炭对PVA-SA小球的机械强度、稳定性、传质性能及氯苯降解降解效果的影响，在PVA-SA小球中加入1%的活性炭时微污染物去除效率最高。